[发明专利]一种高效提取绵羊皮肤组织蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及绵羊皮肤组织蛋白提取的方法，可用于蛋白的Western blot杂交检测，也可用于二维凝胶电泳(2-DE)分离，以及利用皮肤组织制备生物活性的蛋白质。 

背景技术

绵羊皮肤组织致密，结构完善，有着重要的保护作用。绵羊皮肤由表皮和真皮组成，表皮有许多衍生物，如各种腺体、毛、角、爪、甲、蹄；真皮发达，由胶原纤维及弹性纤维的结缔组织构成，两种纤维交错排列，其间分布有各种结缔组织细胞、感受器官、运动神经末梢及血管、淋巴等；相对于其它组织来说，绵羊皮肤组织结构更为复杂，皮肤组织蛋白的提取也较其它组织难度大；获得一种高效提取绵羊皮肤组织蛋白的方法对于研究绵羊组织器官功能、生物活性蛋白制备具有重要意义。 

据文献检索披露：①2010年徐小燕、夏蒲，邢亚楠等在《中国医科大学学报》2010,39(5):336-339. 发表的文章 “冻结破碎法提取组织蛋白方法初探”揭示了冻结破碎法和匀浆法提取小鼠组织蛋白后进行蛋白定量，然后用Western blot检测内参β-actin蛋白的表达，结果表明两种方法提取的总蛋白浓度以及β-actin蛋白表达无明显统计学差异。②2009年王簕、裴国献等在《生命科学研究》2009,13（2）:137-141）发表的“兔骨组织总蛋白的提取和在免疫印迹法中的应用”采用单纯研磨法、单纯锤击法和锤击研磨法分别对兔骨组织蛋白进行提取，通过SDS-PAGE和免疫印迹法检测骨组织中β-actin的表达，比较3种骨组织蛋白提取法，结果表明锤击研磨法更为方便、快捷，可作为提取骨组织蛋白的一种理想方法。③2007年王桂叶等在《郑州大学学报（医学版）》.2007,42(4):660-662.上发明的“3种方法提取胸腺组织蛋白双向电泳纯化结果比较”分别采用组织裂解液法、丙酮沉淀法和蛋白纯化试剂3种方法提取7例重症肌无力患者胸腺组织蛋白质，用SDS-PAGE和二维电泳检测蛋白。结果表明：采用蛋白纯化试剂法提取胸腺组织蛋白，能够获得较好2-DE凝胶图像。检索未见有理想的提取皮肤组织蛋白的方法报道。 

本发明构思是将冷冻破碎与冰浴超声相结合，针对绵羊皮肤组织的特点，在进行皮肤的研磨和蛋白质溶解时，先尽量拔除绵羊皮肤表皮密布的毛发(毛发含有大量的角蛋白)，使角蛋白及非皮肤组织的蛋白质的含量大大降低，从而增加了表皮及真皮组织的蛋白质在溶解液中的相对浓度，有效富集了皮肤组织蛋白，为研究皮肤中蛋白质表达谱和制备皮肤组织的活性蛋白奠定了基础。 

发明内容

本发明目的在于：提供高效提取绵羊皮肤组织蛋白的方法 ，为制备绵羊皮肤组织蛋白和进一步研究绵羊皮肤组织蛋白的功能奠定基础。 

本发明目是这样实现的：一种高效提取绵羊皮肤组织蛋白的方法，分前处理、冷冻破碎、冰浴超声、蛋白定量及SDS-PAGE、Western-blot的检测步骤： 

步骤1.将冰浴皮肤组织样品拔毛处理，用预冷的1×PBS洗涤3次，吸干液体；称取25-30mg样品，置于预冷的2ml离心管中，将其剪碎至0.8-1mm³的小块，置于-70℃冰箱中；

步骤2.取上步样品，加入直径为5-7cm无菌钢珠，置于TissueLyser  LT仪器中粉碎，其频率50Hz，工作2-5min；破碎后，取出钢珠，加入预冷的蛋白酶抑制剂的裂解液，其加量为每100mg湿重组织加200-300μl，置于冰浴中超声破碎，其功率200W，工作10S，间隙15S,25次，且避免大量泡沫产生； 

步骤3.将超声后的样品置于漩涡混合器上涡旋30-40S，4℃、采用13000转/分钟、离心25-30分钟；提取上清液，置于-70℃冰箱中，用BCA法测定其蛋白浓度；取100μg蛋白样品加入等量的2×loading buffer混合均匀，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白；

步骤4.采用Western blotting免疫印迹检测蛋白的表达，即操作：将凝胶放入电转缓冲液中，湿转法100V转印60 min后，加入5％脱脂奶粉室温封闭2 h，用一抗鼠抗HA单抗1∶400稀释，同时以β-actin抗体1:400稀释作内参，4℃过夜孵育，用PBST洗涤5次，每次10 min，用二抗为IRDye? 800CW标记的羊抗鼠IgG抗体1∶12 000稀释，室温孵育50 min，用PBST洗涤5次，每次10 min，再用PBS洗涤一次，用Li-Cor Biosciences扫描成像；