[发明专利]抗猪O型口蹄疫病毒病shRNA设计及载体的构建方法

摘要

本发明涉及一种抗猪O型口蹄疫病毒病shRNA及载体的构建方法，其特征在于根据GenBank中公布的O型口蹄疫基因组序列，选择VP1和3D基因中的保守区段，选取一段19bp长的核酸序列；19bp核酸序列是特异性的只针对猪口蹄疫毒病目的基因，与其他基因没有太大的相似性，根据载体特性，合成发卡结构shRNA对应的DNA序列。其采用合成法并利用基因工程技术构建质粒并将优秀的干扰片段筛选出来，此质粒具有抑制口蹄疫病毒复制的能力，且在细胞水平上能够明显抑制FMDV的复制；根据RNA干扰技术原理我们选择FMDV基因开放阅读框中的VP1和3D基因为进行RNA干扰的靶位点。病毒RNA复制时首先是正链RNA在3D作用下，从其3'端合成其互补链；再以负链为模板合成子代正链RNA。3Dpol的核苷酸序列和氨基酸序列具有高度的保守性。

主权项

一种抗猪O型口蹄疫病毒病shRNA，其特征在于合成抗口蹄疫病毒带shRNA载体的方法如下：根据GenBank中公布的O型口蹄疫基因组序列，选择VP1和3D基因中的保守区段，选取一段19bp长的核酸序列；该序列不要在5’和3’非翻译区及起始密码子后75bp，因为这些区域富含调控蛋白，可能会影响RNA干扰效果；选取19bp核酸序列时要按下列要求进行：1）计算该19bp核酸序列的GC含量，GC含量必须在40%‑60%之间，GC含量大约在45%时最佳；2）在15‑19位点中至少有3个A或T核酸残基，可以增强RNA干扰活性；3）保证19bp核酸序列不会形成二级结构；4）在正义链和反义链寡核苷酸序列之间加入间隔序列TTCAAGAGA，使其能形成发夹结构，在反义链的3'端加入RNA polymerase的终止序列 TTTTTT；19bp核酸序列是特异性的只针对猪口蹄疫毒病目的基因，与其他基因没有太大的相似性，根据载体特性，合成发卡结构shRNA对应的DNA序列。