[发明专利]一种在花生种子中表达人humanin蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种在花生种子中表达人humanin蛋白的方法，是利用基因工程手段将humanin蛋白编码基因连接到油体蛋白基因的3’端，构建由油体蛋白启动子驱动的“油体蛋白-肠肽酶-人humanin蛋白”植物表达载体，转化花生，重组蛋白伴随着油体的积累在花生种子中高水平的表达，然后离心分离出融合蛋白，将融合蛋白用外切蛋白酶消化后离心，去掉油相回收水相，经纯化获得人humanin蛋白。本发明方法获得的重组蛋白安全、活性高、非常容易回收和纯化，而且可以在花生种子中长期的储存、运输方便，大大提升了作物的附加值。

主权项

一种在花生种子中表达人humanin蛋白的方法，步骤包括(1)克隆花生油体蛋白基因Aholeosin及其启动子；(2)合成人humanin蛋白编码基因；(3)构建pCAMBIA2300 Aholeosin humanin OCS植物表达载体；(4)花生的转化；(5)转基因花生种子的获得；(6)Western Blot检测转基因花生种子中humanin蛋白的表达；(7)从转基因花生种子中分离纯化并回收人humanin蛋白；其特征是：所述克隆花生油体蛋白Aholeosin及其启动子的方法是：提取花生基因组DNA，以其为模板，以带有EcoRI酶切位点GAATTC的正向引物：AGAATTCAGGTCAACTACCATTCGT，和带有KpnI酶切位点GGTACC的反向引物：GGTACCAGTTCTCTTTGAATCCTG，利用LA TAQ酶进行PCR反应，PCR反应的程序为：94℃5min；再94℃45sec，54℃45sec，72℃2min，35循环；72℃7min；16℃保存PCR产物；将PCR产物与T载体连接，转化大肠杆菌细胞，选取抗性单克隆测序，确认携带Aholeosin及其启动子的克隆载体；所述合成人humanin蛋白编码基因的方法是：设计并合成部分互补的两条单链DNA引物，其中正向引物包含KpnI酶切位GGTACC和点肠肽酶识别序列(GATGATGATGATAAG)：GAAGGTACCG ATGATGATGA TAAGATGGCT CCACGAGGGT TCAGCTGTCT CTTACTTTTA ACCAGTGAAA TTGACCTGCC；反向引物包含His tag序列(CACCACCACCACCACCAC)和SalI酶切位点(GTCGAC)：ACGCGTCGAC TTAGTGGTGG TGGTGGTGGT GTGCCCGCCT CTTCACGGGC AGGTCAATTT CACTGGTTAA AAGTAAGAGA，利用TAQ酶进行退火和延伸，程序为：94℃3min；40℃1min；72℃2min；16℃保存产物；将产物与T载体连接，转化大肠杆菌细胞，选取抗性单克隆测序，确认携带humanin基因的正确克隆载体；所述植物表达载体pCAMBIA2300 Aholeosin：humanin OCS构建方法是：将按照上述克隆方法获得的Aholeosin及其启动子通过EcoRI和KpnI酶切位点连接到pCAMBIA2300 35S OCS植物表达载体上，获得pCAMBIA2300 Aholeosin OCS载体，再将按照上述克隆方法获得的humanin蛋白编码基因通过KpnI和SalI酶切位点连接到pCAMBIA2300 Aholeosin OCS载体上，获得pCAMBIA2300 Aholeosin humanin OCS植物表达载体；所述花生的转化方法是：将带有目的基因的植物表达载体pCAMBIA2300 Aholeosin humanin OCS通过农杆菌介导的方法侵染花生；所述转基因花生种子的获得的方法是：收获第二代转基因花生纯合体的花生种子；所述Western Blot检测转基因花生种子中人humanin蛋白表达的方法是：用人humanin抗体作为一抗，辣根过氧化物酶作为二抗进行的免疫印迹杂交检测；所述从转基因花生种子中分离纯化并回收人humanin蛋白的方法是指：将获得的花生种子粉碎，抽提液体，离心回收上层油相，得到含融合蛋白的液体；将融合蛋白经酶切后离心，去掉油相回收水相，经纯化获得人humanin蛋白。