[发明专利]一种在花生种子中表达人humanin蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达人humanin蛋白的方法，尤其涉及一种利用油体蛋白系统在花生种子中表达人humanin蛋白的方法，属于生物技术领域。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是以进行性的记忆减退、认知障碍和痴呆为临床表现的老年人常见疾病，发病率随着人口的老龄化而迅速增加，已经成为继心血管疾病、癌症和中风之后的又一严重危害人类健康的疾病。二十一世纪初，日本学者首先分离出一种称为Humanin(HN)的短肽，由24个氨基酸组成。它能有效抑制AD相关基因：淀粉样蛋白前体(amyloid precursor，APP)基因、早老素1(preseniln1，PS1)基因、早老素2(preseniln2，PS2)基因的突变，以及β淀粉样肽(amyloid peptide，Aβ)引起的神经细胞死亡^[1-3]。HN的一级结构具有信号肽结构特点，可被分泌至细胞外，细胞外的HN通过与细胞表面受体结合，继而激活细胞内信号传导通路而发挥其细胞保护作用。此外，有关动物实验表明，脑内注射HN可以改善东莨菪碱引起的动物学习记忆障碍。且Humanin的一种衍生物——Humanin(HNG)，被证实作用较HN强1000倍^[4]。近年来的研究表明，HNG还具有预防和治疗中风^[5]、增强胰岛素活性从而治疗II型糖尿病^[6]的作用。Humanin蛋白作用广泛，临床应用前景广阔，市场需求巨大，因此大规模生产人humanin蛋白意义重大。

利用植物生物反应器是生产药用蛋白的有效方式。已有多种植物用作生物反应器，如烟草、大豆、拟南芥、玉米、油菜、马铃薯块茎、番茄果实、水稻种子等，其表达产物也有多种，如疫苗、抗体等。植物生物反应器成本较低，易于扩大规模，不存在动物细胞培养或微生物发酵中遇到的细胞培养困难、培养基昂贵、污染控制困难等问题。与动物转基因技术相比，植物转基因技术更加成熟。与动物和微生物系统相比，植物本身不携带引起人类疾病的病菌或病毒，避免了病原菌对生物反应器产品的污染。与微生物相比，利用植物生产的产品一般具有较高的生物活性。此外，油料作物种子中的油体蛋白能够高水平表达，可达到种子总蛋白的10％。如果将外源蛋白与油体蛋白融合表达，在提高外源蛋白表达水平的同时，还能简化蛋白的分离程序，有效降低生产成本。

研究表明油体蛋白(oleosin)具有亲水和亲脂双重特性，在植物种子中以膜嵌入方式覆盖在油体表面。油体蛋白分子除中部疏水区域高度保守外，N端和C端的序列差异都很大。油体的性质决定了它是一种易于人工改造的细胞器，小分子量蛋白插入到油体蛋白的N端或C端后，不会影响到油体蛋白在植物油体上的定位和表达，形成的重组融合蛋白非常稳定，通过漂浮离心很容易将它与其他细胞成分分开，易于大规模的蛋白分离纯化。Chen等用三酰甘油酯、磷脂和油体蛋白合成了人工油体(AOB)，只有天然油体的1/10，通过一系列生理实验证明AOB保留了天然油体的特性而且非常稳定^[7]。Peng等利用人工油体优化了油体-油体蛋白表达体系，在大肠杆菌中构建了“油体蛋白-Xa-GFP”表达载体，通过离心，oleosin-GFP全部富集到人工油体的表面，通过蛋白酶Xa将GFP从嵌入油体的油体蛋白中分离，再一次离心，收集上清液得到高浓度的GFP^[8]。Xu等利用大豆24kDa油体蛋白系统，构建了“油体蛋白-肠肽酶-水蛭素”植物表达载体，在转基因烟草中成功表达了重组蛋白，通过肠肽酶切割，分离得到了水蛭素^[9]。SemBioSys公司利用油体-油体蛋白这一系统在拟南芥中表达人胰岛素，植物性胰岛素累积到种子总蛋白含量的0.13％^[10]，经后续试验优化后，种子中积累的胰岛素占种子蛋白总量的1.15％，达到商业应用水平。该公司还利用油体蛋白表达系统在红花中表达人胰岛素，每英亩红花所产的红花籽中能提取到1公斤的人胰岛素，能够有效填补市场需求，利用油菜油体蛋白系统生产水蛭素产品也已经进入商业化阶段。