[发明专利]采用补料分批发酵法制备高密度酪酸菌活菌制剂的方法

摘要

本发明公开了采用补料分批发酵法制备高密度酪酸菌活菌制剂的方法，该方法是由酪酸菌在酪酸菌种子培养基中经二级种子扩大培养和在酪酸菌发酵培养基中发酵，在发酵过程中通过补充碳源、氮源以及用氨水来调节发酵液的pH值等代谢调控措施，来增加酪酸菌的菌体数、芽孢体的转化率以及发酵罐装料系数，再经菌体收集、添加保护剂、喷雾干燥制粉、菌粉检验、包装工序制得;本发明方法生产周期短，酪酸菌的培养密度高，活菌数目较高，生产成本较低，能够大规模产业化生产，产品质量稳定。

主权项

1.采用补料分批发酵法制备高密度酪酸菌活菌制剂的方法，其特征在于包括下述步骤：一级种子培养：取酪酸菌种子冻干管菌种，接种于酪酸菌三角瓶一级种子培养基中，在34-38℃厌氧培养12～16h;  所用培养基的原料及用量为：葡萄糖0.5%-2. 5 %、牛肉膏0.5% -2.0%、酵母浸膏0. 3% -0.5%、磷酸氢二钾0.01% -0.05%、氯化钠0.1%-0.2 %、水94.75-98.59%，培养基的pH 6. 0-7. 0；二级种子培养：将一级种子接种于酪酸菌二级种子培养基中，接种量为酪酸菌二级种子培养基体积的3～9%；在34-38℃厌氧培养12～16h;所用培养基的原料及用量为：葡萄糖1.5%-2.5 %、蛋白胨1.0% -1.5%、酵母粉0. 5% -1.5%、磷酸氢二钾0.02% -0.05%、氯化钠0.1%-0.2 %、硫酸镁0. 02%-0.1%、水94.15-96.86%，培养基的pH 6. 0-7. 2；发酵:将二级种子接种于酪酸菌发酵培养基中，接种量为酪酸菌发酵培养基体积的3～9%；以氮气控制罐压0. 02MPa -0. 04MPa，在34-46℃厌氧培养32-38h；所用培养基的原料及用量为：葡萄糖3.0%-5.0%、酵母粉1.0% -2.5%、黄豆粉2.0% -3.5%、磷酸氢二钾0.05% -0.1%、硫酸镁0. 05%-0.1%、碳酸钙0. 3%-0.6%、硫酸锰0.002%、水88. 2%-93.6%，培养基的pH 5. 8-7. 5 ；当发酵至12-14 h开始流加由葡萄糖10%-20%、水80%-90%配制成的碳源葡萄糖补料培养基，至发酵结束前8小时；当发酵至13-15 h开始流加由豆粉水解液5.0%-10.0%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.1%、水89.8-94.8%配制成的氮源豆粉水解液补料培养基，至发酵结束前10小时；当发酵至12h开始使用重量百分浓度17.0%-24.0%的氨水流加调节pH，使发酵液控制pH6.4-6.8；发酵过程中采用间歇式搅拌，保持培养基浓度均衡；发酵过程中碳源葡萄糖补料培养基与氮源豆粉水解液补料培养基的加入体积比为1：1，但总补料量控制在初始发酵培养基体积的20-40%,最终发酵液装料系数为80-92%；发酵结束前4-6h逐步将发酵温度提高至42-46℃，直至芽抱形成率≥96%，结束发酵；菌体收集:经检验合格的发酵菌液，采用碟片式离心机收集菌体，获得湿菌泥并使用纯化水反复冲洗菌泥；添加保护剂：将所得的湿菌泥称重，按湿菌泥：保护剂=1: 4-30的重量比，加入由脱脂奶粉5%-15%、海藻糖2%-5%、淀粉5%-15%、甘油2%-3%、维生素C0.5%-1%、水61%-85.5% 配制的保护剂，混合均匀；喷雾干燥制粉:将混合好的配有保护剂的菌泥，喷雾干燥，即得酪酸菌干燥菌粉活菌制剂；其中进风温度控制在85-120℃；菌粉检验:每克菌粉含酪酸菌活菌数不少于1.0×10¹⁰个;上述各级种子培养基、发酵培养基、补料培养基、保护剂均需要经过110-123℃,15-30分钟的蒸汽湿热实罐灭菌，灭菌后，培养基要迅速降至36-37℃；上述各级种子培养基、发酵培养基、补料培养基中的原料用量均为重量百分比；配制时保证所用原料的重量百分比之和为100%。