[发明专利]辣椒细胞质雄性不育系原生质体分离纯化及愈伤组织形成的方法

摘要

辣椒细胞质雄性不育系原生质体分离纯化及愈伤组织形成的方法，涉及原生质体来源、分离、纯化及原生质体培养和愈伤组织形成，属于生物技术科学领域。1）利用辣椒细胞质雄性不育系无菌苗真叶为材料分离原生质体；2）切取幼嫩叶片放入含有纤维素酶、果胶酶和离析酶的CPW9酶解溶液中，置于27℃摇床上黑暗处理；3）用300目尼龙筛过滤酶解液，经离心洗涤后收集原生质体；4）将获得的原生质体培养于含有不同浓度激素的液体培养基中，期间定期添加新鲜培养基，直至愈伤组织形成。该发明利用辣椒雄性不育材料进行原生质体分离和培养，对进一步研究原生质体融合以及利用融合技术实现新型辣椒雄性不育系材料的创制具有重要的意义。

主权项

辣椒细胞质雄性不育系原生质体分离纯化及愈伤组织形成方法，其特征在于包含以下步骤：1）无菌苗准备：利用辣椒细胞质雄性不育系相对应保持系的花粉对不育系进行授粉，50天后采收自然成熟果实；在超净工作台上，用75%vt酒精对果实表面进行消毒，将果实剖开取成熟种子接种到1/2MS固体培养基上生长，取培养30~40天健壮无菌苗的真叶作游离叶肉原生质体的材料；2）原生质体分离和纯化：取无菌苗真叶1g，将其切成1~2mm宽的细条，置于盛有10mL酶解液的50mL离心管中，封口膜封口，在28℃黑暗条件下放置回旋摇床上酶解；酶解液组成为：含9%wt甘露醇的CPW9+0.5%~1%纤维素酶(w/v)+0.25%~0.5%果胶酶(w/v)+0.1%~0.2%离析酶(w/v)；酶解2~6小时，将酶解后的混合物用300目无菌尼龙网过滤，滤液在50mL离心管中以500~1000转/min转速离心3~8min，去上清液，用CPW9溶液悬浮底部沉淀的原生质体，洗涤离心2次；3）原生质体悬浮培养：以KM8P培养基悬浮、洗涤2）中原生质体，用血球计数板统计原生质体产量，0.01%FDA检验原生质体活力；然后用含有植物激素0.5~2.0mg/L 6‑BA、0.5~2.0mg/L 2,4‑D和0.5~2.0mg/L KT的KM8P培养液悬浮原生质体1次，稀释成密度约105个/mL原生质体进行液体浅层培养；4）愈伤组织形成：前3周进行暗培养，每隔1周添加1mL步骤3）所用的含有不同激素的KM8P培养基，3周后将培养物于漫射光下进行培养，当出现肉眼可见的愈伤组织时，将其转移至扩增培养基弱射光下培养。