[发明专利]一种血清MICA蛋白及其mRNA的检查方法

摘要

本发明公开了一种血清MICA蛋白及其mRNA的检查方法，包括以下步骤：步骤一：取人体的静脉血存于-80℃冰箱中待检测；步骤二：血清MICA蛋白含量的检测采用westernblot法；步骤三：血清或者细胞内MICAmRNA表达水平的检测。本发明提供了一种血清MICA蛋白及其mRNA的检查方法，为进一步研究肝移植等器官移植手术的排斥反应，提供支持。

主权项

一种血清MICA蛋白及其mRNA的检查方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一：取人体的静脉血存于‑80℃冰箱中待检测；步骤二： 血清MICA蛋白含量的检测采用western blot法a.3ml静脉全血离心后提取血清1ml，用ELISA法进行蛋白定量，PVDF膜在5%脱脂奶粉溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合；b.将上述准备好的样品液和预染蛋白marker分别上样，进行变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳分离蛋白；c.蛋白质转移到PVDF膜，按Bio‑Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4℃转移过夜；d.PVDF膜在5%脱脂奶粉溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合蛋白，封闭过的膜加入抗MICA一抗，室温孵育1.5小时，抗原抗体结合，加入HRP标记的二抗,室温孵育膜1小时；e.pvdf膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影,图片扫描保存为电脑文件；步骤三：血清或者细胞内MICA mRNA表达水平的检测a.提取RNA:3ml静脉全血离心后提取血清1ml；b.逆转录合成cDNA第１链及第２链；c.将逆转录合成的cDNA进行PCR扩增：在50ul的反应体系中加入1ul上述cDNA、2.5ul Taq酶和2.5ul抗Taq酶，5’端引物序列为ATGCCCCAGTCCTCCAGA，3’端引物为GTGGCATCCC TGTGGTCA，内参基因选择为beta‑actin，PCR周期设置为94℃变性1分钟，64℃复性1分钟，聚合过程45秒，进行30个周期的扩增；采用BigDye Terminator Cycle sequencing kit and Abi Prism 310 试剂盒测定扩增的DNA产物，与内参基因对比的水平即MICA mRNA的表达水平。