[发明专利]动物细胞内核蛋白提取方法

摘要

本发明公开了一种动物细胞内核蛋白提取方法。该方法通过利用细胞穿透肽、外源核蛋白和绿色荧光蛋白共同构建重组核蛋白表达载体，介导重组核蛋白在细胞核内表达，待重组核蛋白在细胞内表达稳定后，使用操作液处理细胞，收集细胞，超声波破碎，离心去沉淀后收集细胞上清液，上清液过滤除菌后添加到细胞培养液中，4h后提取的荧光标记外源重组核蛋白通过细胞质进入细胞核并定位于细胞核内。利用该方法提取的核蛋白能够发挥蛋白功能使细胞发生形态特征的改变，结果证实本发明能够简单、快速、高效地提取具有生物活性的细胞内核蛋白。

主权项

一种动物细胞内核蛋白提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)核蛋白的表达用高糖DMEM培养液培养传代293T细胞，经过多次培养传代后选择生长速度快、生长状态好的293T细胞用作核蛋白表达细胞；待293T细胞生长到对数生长期时；分别采用磷酸钙沉淀法介导Oct4、Sox2、Myc、Klf4重组核蛋白表达载体在293T细胞内表达；(2)核蛋白的提取荧光显微镜下观察核蛋白在293T细胞中的表达，待重组核蛋白在细胞内表达稳定后，分别选取核蛋白表达的293T细胞，去除培养皿中的高糖DMEM培养液，添加含秋水仙素的高糖DMEM培养液处理细胞，待处理细胞形态出现变化后，将293T细胞连同培养液一起收集到离心管中4℃放置；取出4℃状态下的细胞悬液，4℃离心去上清液，用4℃预冷的高糖DMEM培养液重悬细胞沉淀，离心洗涤细胞并去上清液，用4℃预冷的高糖DMEM培养液再重悬细胞沉淀，同时加入蛋白酶抑制剂，轻轻吹打混匀后冰浴中超声破碎细胞，4℃离心去沉淀后收集上清液过滤除菌，4℃放置备用。