[发明专利]串联抗菌肽Alloferon-1的制备方法及rAlloferon-1-K的应用

摘要

本发明涉及一种抗菌肽的制备方法及其应用。目的是提供一种步骤简捷、表达效率高而又保持其体外抗肿瘤活性的抗菌肽Alloferon-1的制备方法以及rAlloferon-1-K的应用。技术方案是：串联抗菌肽Alloferon-1的制备方法，包含以下步骤：1）设计一对末端单链DNA；2）PCR体系中生成串联体；3）电泳筛选14拷贝Alloferon-1串联体；4）构建原核重组表达系统E.coliBL21DE3pET42a-14×Alloferon-1-K；5）重组蛋白14rAlloferon-1-K表达提纯；6）胰蛋白酶酶切14rAlloferon-1-K，提纯获得rAlloferon-1-K。

主权项

串联抗菌肽Alloferon‑1的制备方法，具体包含以下步骤：1）设计一对非镜像对称含互补粘性末端单链DNA；正链序列：5’‑磷酸化‑CATGGCGTGAGCGGCCATGGCCAGCATGGCGTGCATGGCAAA‑3’，负链序列：5’‑磷酸化‑GCCATGGCCGCTCACGCCATGTTTGCCATGCACGCCATGCTG‑3’；2）在PCR反应体系中，通过退火，获得单拷贝双链DNA，利用互补粘性末端在PCR体系中随机串联，生成不同拷贝的串联体；3）T‑A克隆产物琼脂糖电泳筛选14拷贝Alloferon‑1串联体，测序鉴定；4）用测序鉴定正确的T‑A克隆14拷贝Alloferon‑1串联体构建原核重组表达系统E.coli BL21DE3pET42a‑14×Alloferon‑1‑K；5）IPTG诱导目的重组蛋白14rAlloferon‑1‑K表达，Ni‑NTA亲和层析提纯并收集目的重组蛋白；6）胰蛋白酶酶切14rAlloferon‑1‑K，Sephadex G‑50 层析法提纯获得 rAlloferon ‑1‑K，浓缩后检测rAlloferon‑1‑K浓度。