[发明专利]人呼吸道合胞病毒F蛋白的纯化方法

摘要

本发明公开了一种人呼吸道合胞病毒F蛋白的纯化方法。该方法通过以RSV感染HEp-2细胞或Vero细胞，待细胞出现完全病变后，收获细胞及培养基，离心，取上清，PEG6000沉淀，获得的沉淀物经溶解后通过蔗糖密度梯度离心进一步纯化，纯化的病毒经裂解液溶解包膜蛋白后，蛋白粗提溶液依次经过离子交换层析和凝胶过滤层析对F蛋白进行纯化。经过两步层析可以得到高度纯化的F蛋白，且在纯化过程中保持了F蛋白的抗原性，纯化的F蛋白仍然能被一组单克隆抗体检测到。

主权项

一种人呼吸道合胞病毒F蛋白的纯化方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）细胞与病毒培养：将HEp‑2细胞或Vero细胞培养于含有血清的DMEM培养基中，待细胞丰度为80%~90%时，接种人呼吸道合胞病毒，然后更换含血清的DMEM培养基继续培养细胞，细胞出现完全病变后收集细胞及培养基，离心，收集上清作为病毒贮液；（2）病毒的浓缩与纯化：所述病毒贮液利用聚乙二醇沉淀法进行浓缩，然后通过蔗糖密度梯度离心进一步纯化，得到病毒混悬液；（3）病毒的裂解：向所述病毒混悬液中加入病毒裂解液，4℃裂解20~30min，然后加入缓冲液A稀释3~5倍，离心，取上清，得到病毒蛋白粗提液；其中，所述病毒混悬液与病毒裂解液的体积比为1:5~1:10，所述病毒裂解液为含有250 mM 蔗糖，25 mM MES‑NaOH，10 mM NaCl，0.5% Triton X‑100，2mM EDTA，1 mM PMSF，pH 5.7的溶液；所述缓冲液A为含有25 mM MES‑NaOH，0.03% Triton X‑100和10 mM NaCl，pH 5.7的溶液；（4）离子交换柱层析纯化：采用阴离子交换层析柱，先用缓冲液A平衡柱子，之后上样病毒蛋白粗提溶液，经2倍柱体积缓冲液A清洗后，采用缓冲液A和缓冲液B混合缓冲液，进行线性梯度洗脱，梯度洗脱过程中，混合缓冲液中缓冲液B的含量从0线性递增至100%，洗脱5~15个柱体积，收集穿透峰和各洗脱峰，进行SDS‑PAGE和Western Blot分析检测，得到阳性洗脱组分，其中所述缓冲液B为含有25 mM MES‑NaOH，0.03% Triton X‑100，1M NaCl，pH 5.7的溶液；（5）凝胶过滤柱层析纯化：采用凝胶过滤层析柱，先用缓冲液C平衡柱子，上样经离子交换层析柱得到的阳性洗脱组分，然后用缓冲液C洗脱，收集各洗脱峰，进行SDS‑PAGE和Western Blot分析检测，得到阳性洗脱液，然后将该洗脱液冻干，即得；其中，所述缓冲液C为含有25 mM MES‑NaOH，0.03% Triton X‑100，150 mM NaCl，pH 5.7的溶液。