[发明专利]一种重组鸡β干扰素的制备方法及其应用

摘要

本发明属于分子免疫学技术领域，具体涉及一种体外高效制备鸡β干扰素的方法及其应用。主要技术方法如下：利用PCR的方法从鸡肝基因组中扩增出鸡β干扰素基因，将该基因连接到PET28a载体上,构建出重组鸡β干扰素成熟蛋白基因重组载体并转入BL-21大肠杆菌表达系统。鸡β干扰素在大肠杆菌中获得了高效表达，表达的鸡β干扰素的包涵体经过高浓度尿素变性后，经NI-NTA的亲和层析柱纯化，收集洗脱峰并用梯度尿素浓度溶液复性。本发明中的重组鸡β干扰素具有很好的抗病毒的生物学活性，且生产成本低，生产效率高，生物活性好，非常适合企业化生产。

主权项

1.一种重组鸡β干扰素的生产方法，其特征是由以下步骤构成：重组载体PET28a-chIFNβ的构建根据genbank上公布的序列，设计一对引物，通过PCR的方法扩增出鸡β干扰素成熟蛋白基因；把鸡β干扰素成熟蛋白基因的PCR产物酶切后与同样两种限制性内切酶酶切的PET28a表达载体相连，连接产物在大肠杆菌中增殖后，转化菌培养后重新提取的质粒经EcoR I和Sal I酶切；酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定发现，531bp大小的鸡β干扰素成熟蛋白基因核酸条带清晰可见，说明重组PET28a-chIFNβ载体已经构建成功，重组载体转化BL-21菌后，通过IPTG进行诱导表达；大肠杆菌表达的鸡β干扰素包涵体的制备、变性、纯化与复性工艺将1000ml诱导表达菌经8000rpm/min×10min离心后收集的菌体用pH=7.2的PBS洗涤一次，洗涤后离心的菌体用40ml的50mM的Tris-HClPH8.0, 含1mM的EDTA悬起，-20℃作用过夜；次日以450W功率的超声波裂解25min3S,3S后，4℃，2000g/min×10min离心后取上清，再8000rpm离心20min后取沉淀，即得重组鸡β干扰素包涵体；包涵体用含1% TritonX-100的50mM的Tris-HClPH8.0, 含1mM的EDTA溶液洗涤后，再用含2M尿素的50mM的Tris-HClPH8.0, 含1mM的EDTA溶液洗涤，洗涤后的沉淀用含1mM EDTA和10mM的DTT的8M的50mM的NaH₂PO₄(PH8.0),0.3M的NaCl，50mM的咪唑溶液4℃搅拌溶解12h；溶解后的重组鸡β干扰素包涵体变性液上清经0.22um的滤膜处理后，用含NI-NTA层析介质的亲和层析柱对其进行亲和纯化；NI-NTA层析介质装柱后用10个柱体积的亲和层析的平衡液进行平衡，流速控制在每分钟1ml；平衡后在层析介质上轻轻铺上经过洗涤纯化的重组鸡β干扰素包涵体变性液，然后加入20个柱体积的亲和层析漂洗液进行漂洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，最后用5个柱体积的洗脱液进行洗脱；收集洗脱峰放入截留分子量为3KD的透析带，以含5M尿素的PBS溶液进行透析，每8h换一次透析液，共透析16h；继而分别以含3M,1M尿素的PBS溶液进行透析，同样是每8h换一次透析液，不同尿素浓度的透析液各透析16h，最后以PBS溶液透析24h，每8h换一次透析液；透析复性结束后的鸡β干扰素溶液用0.22um的滤膜后，测定蛋白浓度为0.26mg/ml,-20℃保存备用，亲和层析的平衡液为含8M尿素的50mM的NaH₂PO₄PH8.0,0.3M的NaCl，50mM的咪唑溶液，漂洗液为含8M尿素的50mM的NaH₂PO₄PH8.0,0.3M的NaCl，100mM的咪唑溶液.洗脱液为含8M尿素的50mM的NaH2PO₄(PH8.0),0.3M的NaCl，500mM的咪唑溶液。