[发明专利]一种双酚A的荧光偏振免疫分析检测方法

摘要

一种双酚A的荧光偏振免疫分析检测方法，属于荧光偏振免疫检测技术领域。本发明利用双酚酸作为半抗原偶联FITC荧光素衍生物，合成荧光标记物，并以双酚A为标准品，双酚A多抗为抗体，建立了双酚A的荧光偏振免疫分析方法。本发明建立了双酚A的荧光偏振免疫分析方法，为双酚A的残留检测提供了一种快速高效的检测方法。本发明方法操作简便、快速、成本低，结果可靠。灵敏度为2ng/mL，线性范围为20～800ng/mL。免疫反应的高特异性和亲和性使荧光偏振免疫分析方法具有极高的选择性和灵敏度。

主权项

1.一种双酚A的荧光偏振免疫分析检测方法，其特征在于利用双酚酸作为半抗原偶联FITC荧光素衍生物合成荧光标记物，并以双酚A为标准品，用双酚A多抗为抗体，建立双酚A的荧光偏振免疫分析检测方法；步骤如下：（1）FITC荧光素衍生物EDF的制备：分别量取200mg乙二胺盐酸盐，500μL三乙胺，溶解于50mL的甲醇中，得含乙二胺盐酸盐的三乙胺溶液；117mg的荧光素FITC，100μL的三乙胺，溶解于10mL的甲醇中，得FITC溶液；逐滴将FITC溶液滴加入含乙二胺盐酸盐的三乙胺溶液中；混合溶解，室温避光下搅拌反应10h，然后过滤分离出沉淀，干燥，得FITC荧光素衍生物EDF，避光保存；（2）EDF标记物的制备：N-羟基琥珀酰亚胺NHS 9.2mg，二环己基碳二亚胺DCC16.4mg，和双酚酸1.4mg，溶解于2.0mL的DMF中，室温下搅拌过夜；向反应溶液中加入FITC荧光素标记物的衍生物EDF 2-3mg，室温下避光搅拌反应3h，制得EDF标记物；（3）EDF标记物的纯化：以CHCl₃/MeOH=1:1为展开液，室温下进行薄层层析，分离纯化EDF标记物，紫外透射仪下观察，选择R_f=0.56的条带，用300 μL甲醇萃取；（4）EDF标记物工作浓度的确定：用0.025M、pH8.0硼酸盐缓冲液稀释不同浓度的EDF标记物，上偏振仪检测偏振光强度，以10倍于空白溶液的偏振光强度作为其工作浓度；确定选取1:1500稀释作为工作浓度；空白溶液选用0.025M、pH8.0硼酸盐缓冲液；（5）双酚A多抗的工作浓度的确定：在每个试管中依次加入500μL用0.025M、pH8.0硼酸盐缓冲液稀释成不同稀释浓度：1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800的双酚A多抗，并依次加入500 μL的EDF标记物，室温下孵育5min，上偏振仪检测偏振光值，确定选取1:800稀释作为抗体的工作浓度；（6）竞争：双酚A用超纯水稀释成1，5，25，125，625，3125，15625，78125ng/mL 系列浓度分别加入不同的试管中，另设一个超纯水空白对照，50μL/管；然后向每个试管中加入500μL稀释1500倍的EDF标记物，最后分别加入500μL稀释800倍的双酚A多抗于室温下孵育5min，上偏振仪检测偏振光值；（7）建立双酚A的标准抑制对数曲线：将所测得的检测偏振光值为纵坐标，以双酚A浓度为横坐标作图建立双酚A的标准抑制对数曲线；（8）实际样品的检测：以实际样品按步骤（6）的方法进行检测，测得的偏振光值以双酚A的标准抑制对数曲线对照，确定样品的双酚A残留浓度。