[发明专利]一种提纯柑橘果肉有色体的方法

摘要

本发明属于植物生化领域。具体涉及应用密度梯度离心提纯柑橘果肉有色体的方法。步骤是：1)将甜橙果实加缓冲液A榨汁，过滤；滤液离心，取上清，离心，得沉淀；用缓冲液A稀释，得样品；2)取离心管，用灭菌牛血清涂匀内壁；用缓冲液A将30％的缓冲液B稀释为梯度液，取样品Ⅰ加到密度梯度上面，离心；富集重量体积比为15％有色体层，将沉淀稀释，离心得沉淀，沉淀用缓冲液A稀释，得样品Ⅱ；3)取离心管，用灭菌牛血清涂匀内壁；用缓冲液A将30％的缓冲液B稀释成梯度稀释液；取样品Ⅱ加到梯度上面，离心，富集7.5％的有色体层，稀释，离心，去上清并将沉淀稀释，离心，得样品Ⅲ；4)取样品Ⅲ，重复3)；将7.5％有色体沉淀，稀释，离心，得柑橘果肉有色体。

主权项

一种提纯柑橘果肉有色体的方法，其特征在于，用海碘醇配成的溶液为梯度液，进行三次密度梯度离心，得到提纯的有色体；其步骤包括：(1)取甜橙果实，剥皮并去掉种子，将果肉切成块状，称重80克样品，加入300ml缓冲液A，用榨汁机榨汁8‑10秒，将得到的果肉混合样品通过两层米拉滤布过滤，得到滤液；将滤液倒入离心管中，用离心机以400g离心5min，去沉渣后，得到上清液；将上清液用离心机的水平转头以6000g，离心10min，得到沉淀；将富集的沉淀加入12ml缓冲液A稀释，得到待用的样品Ⅰ，待用；(2)取10ml的离心管，用灭菌过的牛血清将内壁涂匀；用缓冲液A将重量体积比为30％的缓冲液B分别稀释成重量/体积为24％，20％，15％的梯度稀释液，体积分别为1.5ml、2.0ml、2.2ml、2.0ml配制成不连续密度梯度，取步骤(1)待用的样品2ml加到密度梯度上面；用离心机在水平转头下以6750g，离心45min；吸取第一层即重量体积比为15％的有色体层，并将沉淀稀释10倍，用离心机角转头以6000g离心7min得到沉淀，并将沉淀用2ml缓冲液A稀释，得到待用样品Ⅱ，待用；(3)取10ml的离心管，用灭菌过的牛血清将内壁涂匀；用缓冲液A将重量体积比为30％的缓冲液B分别稀释成重量/体积为12.5％，10％，7.5％，5％的梯度稀释液，体积分别为1.3ml，1.7ml，2.5ml，2.0ml配制成不连续密度梯度；取第(2)步待用的样品Ⅱ2ml轻轻加到梯度上面，用离心机水平转头，以离心速度为6750g，离心45min，富集第二层即重量体积比为7.5％的有色体层，将富集的有色体层稀释10倍，用离心机以离心速度6000g离心7min，去上清取并将沉淀稀释5倍，以600g，离心15min，得到待用的样品Ⅲ，待用；(4)将第(3)步富集得到待用的样品Ⅲ为样品，重复第(3)步骤；将富集得到的重量体积比为7.5％的有色体沉淀，稀释10倍，离心6000g，7min以去掉多余的海碘醇，沉淀稀释10倍，再以离心速度为2000g，离心10min，得到最终的有色体；其中：缓冲液A、B的配方组成如下：缓冲液A1mM      焦磷酸四钠；50mM     羟乙基哌嗪乙磺酸；pH＝6.8；330mM    山梨醇；2mM      乙二胺四乙酸；1mM      MgCl2；2mM      MnCl2；2mM      二巯基苏糖醇；缓冲液B按照重量/体积计的配方如下：30％(W/V) 碘海醇；1mM       焦磷酸四钠；50mM      羟乙基哌嗪乙磺酸；pH＝6.8；330mM     山梨醇；2mM       乙二胺四乙酸；1mM       MgCl2；2mM       二巯基苏糖醇。