[发明专利]珍珠蚌铜锌超氧化物歧化酶的制备方法

摘要

一种珍珠蚌铜锌超氧化物歧化酶的制备方法。是通过提取一种育珠蚌褶纹冠蚌的总RNA，用反转录及PCR技术获得褶纹冠蚌铜锌超氧化物歧化酶基因的全长cDNA，将cDNA克隆到pET30载体上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组工程菌。将工程菌在LB培养基中高密度培养，用IPTG诱导，同时在培养基中加一定浓度的Cu2+和Zn2+后，重组基因得到大量表达。产物经亲和层析柱，得到纯化的重组超氧化物歧化酶。该发明准确获得含有155个氨基酸残基的成熟蛋白序列，该酶具有抗氧化、抗衰老作用。本方法获得的菌体产量高，表达量高，活性高，产物对酸碱、温度、变性剂均很稳定，对乙醇损伤的LO-2肝细胞具有明显的保护作用，且易纯化，具有广阔的工业应用前景。

主权项

一种珍珠蚌铜锌超氧化物歧化酶的制备方法，包括从生物组织或血细胞中提取总RNA，克隆铜锌超氧化物歧化酶基因，将酶基因与原核表达质粒连接，转化大肠杆菌，通过筛选得到工程菌，将工程菌高密度培养，通过诱导，纯化得到铜锌超氧化物歧化酶，其特征在于：(1)从健康的褶纹冠蚌组织或血细胞中提取总RNA，反转录成cDNA后用表达引物SODFb：5′ AAG GGT ACC ATG TCC ATT AAG GCT GTT TGC G 3′，SODRb：5′ GGA GAATTC TCA ATC CAA TTT TGA AAT TCC 3′对铜锌超氧化物歧化酶基因进行PCR扩增；(2)选用PET30原核表达质粒与目的基因连接；(3)用卡那霉素LB培养基对重组菌进行筛选；(4)在诱导过程中，培养基内添加Cu2+离子和Zn2+离子，诱导温度为20℃ 25℃；(5)通过镍离子亲和柱层析对产物进行纯化；(6)用聚乙二醇8000对蛋白进行浓缩。