[发明专利]人原代肝细胞分离培养方法

摘要

本发明提供了一种人原代肝细胞分离培养方法，包括以下步骤：用D-Hank’s液清洗肝组织表面血块，并将结缔组织剪除；用针头注射器多点穿刺灌注预温38℃的前灌流液，使肝组织块由暗红色变为灰白色且流出的前灌流液变清亮；继以预温的II型胶原酶溶液针头多点穿刺灌注，直至组织块变疏松、失去弹性，表面呈龟背状裂隙，II型胶原酶溶液可循环使用；剪开组织块，钝性分离肝组织，并去除残存的包膜和纤维结缔组织，然后继续在II型胶原酶溶液中37℃震荡消化；将消化物吹打为细胞悬液，在冰浴条件下，过滤，收集过滤后的肝细胞悬液，移至离心管中，低速离心；第一次低速离心所得底层沉淀加入红细胞裂解液，吹打，室温静置后加入DMEM混匀清洗、低速离心，再加入DMEM混匀、低速离心重复2-4次，最后一次低速离心所得沉淀加入Williams’Medium E完全培养基悬浮；调整肝细胞密度为1×105/ml，接种于铺有鼠原胶原的培养瓶中，于CO2培养箱中37℃恒温培养，贴壁后，换液除去死亡及未贴壁细胞，继续培养。本发明建立的人原代肝细胞培养模型简便易行，成本低。

主权项

一种人原代肝细胞分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：用D‑Hank’s液清洗肝组织表面血块，并将结缔组织剪除；用针头注射器多点穿刺灌注预温38℃的前灌流液，使肝组织块由暗红色变为灰白色且流出的前灌流液变清亮；继以预温的II型胶原酶溶液针头多点穿刺灌注并循环使用，直至组织块变疏松、失去弹性，表面呈龟背状裂隙；剪开组织块，钝性分离肝组织，并去除残存的包膜和纤维结缔组织，然后继续在II型胶原酶溶液中37℃震荡消化；将消化物吹打为细胞悬液，在冰浴条件下，过滤，收集过滤后的肝细胞悬液，移至离心管中，低速离心；第一次低速离心所得底层沉淀加入红细胞裂解液，吹打，室温静置后加入DMEM混匀清洗、低速离心，再加入DMEM混匀、低速离心重复2‑4次，最后一次低速离心所得沉淀加入Williams’Medium E完全培养基悬浮；调整肝细胞密度为1×105/ml，接种于铺有鼠原胶原的培养瓶中，于CO2培养箱中37℃恒温培养，贴壁后，换液除去死亡及未贴壁细胞，继续培养。