[发明专利]人原代肝细胞分离培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及肝细胞体外培养生物技术领域，尤其是涉及一种稳定简便的人原代肝细胞分离培养方法。

背景技术

肝细胞在医学相关领域得到极为广泛的应用，长期以来，国内外众多学者对原代肝细胞分离方法、培养条件进行了大量的研究，但要获得高活率、功能好的肝细胞，至今仍较困难，尤其是人原代肝细胞。早期分离肝细胞的方法主要是非酶法分离肝细胞，包括机械法(如匀浆法)及螯合法。但是机械法对肝细胞损伤大，分离下来的肝细胞活率低；螯合法是用可结合Ca²⁺、Mg²⁺的螯合剂(如枸橼酸盐或EDTA)分离肝细胞，但螯合剂单独使用效果不好，常需与酶法结合使用。后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞，包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法等。现在广泛使用的是两步原位灌流法，这是目前国际上流行的肝细胞分离方法。先从门静脉用无钙、含氧前期缓冲液，冲出血细胞和钙离子，再换含蛋白水解酶的溶液至组织软化。此法分离获得的肝细胞几乎为纯的肝实质细胞，不仅数量多，活性高，而且保留了肝细胞的各种功能。但使用该方法不仅灌流装置价格昂贵，操作环节多，技术要求高，所需时间长，易污染，而且对于一般以手术切除而获得的人肝组织并不适用，所以限制该方法在一般实验室以及人原代肝细胞在医学中的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述缺陷，提供了一种简便有效的分离培养人肝细胞的方法，特别是针对以手术切除获得的人肝组织来进行的人原代肝细胞的分离培养方法。

本发明提供了一种人原代肝细胞分离培养方法，包括以下步骤：

用D-Hank’s液清洗肝组织表面血块，并将结缔组织剪除；

用针头注射器多点穿刺灌注预温38℃的前灌流液，使肝组织块由暗红色变为灰白色且流出的前灌流液变清亮，最好用5ml针头注射器，灌注时压力、流速要恒定，不能有气泡；

继以预温的II型胶原酶溶液针头多点穿刺灌注，直至组织块变疏松、失去弹性，表面呈龟背状裂隙，II型胶原酶溶液可循环使用，为保持胶原酶溶液温度，可将标本至于热水袋上操作；

剪开组织块，钝性分离肝组织，并去除残存的包膜和纤维结缔组织，然后继续在II型胶原酶溶液中37℃震荡消化；

将消化物吹打为细胞悬液，在冰浴条件下，过滤，收集过滤后的肝细胞悬液，移至离心管中，低速离心；

第一次低速离心所得底层沉淀加入红细胞裂解液，吹打，室温静置后加入DMEM混匀清洗、低速离心，再加入DMEM混匀、低速离心重复2-4次，最后一次低速离心所得沉淀加入Williams’Medium E完全培养基悬浮；

调整肝细胞密度为1×10⁵/ml，接种于铺有鼠原胶原的培养瓶中，于CO2培养箱中37℃恒温培养，贴壁后，换液除去死亡及未贴壁细胞，继续培养。

优选地，前灌流液为去离子水配制的溶液，该溶液中包含的成分及浓度为：NaCl 8.000g/L，KCl 0.400g/L，NaHCO₃ 0.350g/L，HEPES 2.380g/L，NaH₂PO₄2H₂O 0.078g/L，Na₂HPO₄12H₂O 0.151g/L，EDTA 0.190g/L，Glucose 0.900g/L。

优选地，II型胶原酶溶液为去离子水配制的溶液，该溶液中包含的成分及浓度为：NaCl 3.945g/L，KCl 0.500g/L，CaCl₂2H₂O 0.700g/L，HEPES 24.00g/L，collagenase Type II 500mg/L。

优选地，所述Williams’Medium E完全培养基为Williams’Medium E中加入青霉素100KU/L，链霉素100mg/L，Hyclone胎牛血清10％配置而成，培养基PH值为7.2。

优选地，上述步骤中的过滤为先用150目滤网过滤，收集过滤后的肝细胞悬液，再用200目滤网过滤。上述步骤中的低速离心为10g，3-5分钟。

与现有技术相比，本发明的分离培养方法中，仅用一个注射器就替代了经典的肝细胞原代分离培养中使用的灌流装置，运用多点穿刺灌注的方法克服了手术标本无法体外灌流的缺点，同时大大的节约了胶原酶以及灌注液的使用，节约了成本。因此，本发明建立的人原代肝细胞培养模型简便易行，成本低。

附图说明