[发明专利]一种生物柴油脂肪复合酶的制备方法

摘要

本发明提供了一种新的生物柴油专用脂肪复合酶的生产方法，其步骤包括：少根根霉D6D脂肪酸脱氢酶基因的截取，PCR扩增，构建表达载体通过酿酒酵母表达，获得高产脂肪酸脱氢酶菌种，废弃油脂经脂肪酸脱氢酶脱氢转化为不饱和脂肪酸再由脂肪酶酯化反应生成脂肪酸甲酯。采用甲基磺酸乙酯(EMS)，紫外光照及LiCl复合诱变处理青霉菌，定向扩大培养诱变菌种，发酵获得扩展青霉脂肪酶。研究将脂肪酸脱氢酶与脂肪酶复配并固定化生产生物柴油，固定化后的复合酶酶活稳定性和使用寿命都大大提高。本发明操作工艺简单、设备要求低、产率大，适于大规模工业化生产。

主权项

一种生物柴油脂肪复合酶的制备方法，其特征包括以下几个步骤：(1)研究选取脂肪酸脱氢酶的DNA序列，并尝试在酿酒酵母中表达。D6D脂肪酸脱氢酶是长链多不饱和脂肪酸合成的限速酶。利用RT‑PCR和RACE方法，从少根根霉中得到全长为1 482bp的一段cDNA序列就，通过序列分析和已报道的D6D脂肪酸脱氢酶进行比较，结果显示其开放阅读框编码的氨基酸序列和卷枝毛霉、高山被孢霉和畸雌腐酶的D6D脂肪酸脱氢酶具有最大同源性。将编码序列构建重组表达载体，并转入酿酒酵母中表达，结果在添加外源性底物亚油酸以及半乳糖诱导后，经GC和GC‑MS分析表明，重组细胞特异性的将亚油酸转化为GLA，GLA含量占总脂肪酸含量的3.85％，初步表明该序列的表达产物具有D6D脂肪酸脱氢酶的功能。以上序列和功能分析结果表明，从少根根霉中所克隆的cDNA序列为新的D6D脂肪酸脱氢酶的基因。脂肪酸先经脂肪酸脱氢酶脱氢转化成不饱和脂肪酸，然后再由脂肪酶生成脂肪酸甲酯。(2)青霉菌的诱变及定向扩大培养对青霉菌进行紫外光照，选取生长旺盛菌落。用EMS溶液做成孢子悬浮液，加入Na2SO3溶液，终止反应。稀释孢子悬浮液，再对其进行紫外光照，筛选旺盛菌种，涂布于含LiCl双层筛选平板。如此反复两到三次，筛选出高产青霉菌种。(3)复合酶复配按照脂肪酶复合酶标准要求添加高酶活力的单酶复配，使脂肪酸脱氢酶和脂肪酶酶活力达到产品标准，添加载体，制成一种生物柴油专用复合酶。(4)复合酶的固定化经过研究表明采用聚乙二醇复合材料作为固定化酶的载体在稳定性、使用温度和转化率各方面都有较大的优势。