[发明专利]一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法

摘要

一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，属生物制剂检测技术领域，其特征在于：先制备茶尺蠖核型多角体病毒多角体蛋白单克隆抗体，然后将待检样品进行包被，使用间接Elisa方法进行检测。本发明借助免疫学手段，突破了传统的生物测定技术，解决了茶尺蠖核型多角体病毒的准确定性问题。与传统生物测定方法相比，本方法毒力指标检测更为精细，毒力评价周期大大缩短，可广泛用于病毒制剂质量的评定，规范茶尺蠖病毒的生产应用。

主权项

一种茶尺蠖核型多角体病毒的定性检测方法，其特征在于包括以下步骤：1)制备茶尺蠖核型多角体病毒单克隆抗体；2)样品检测；所述的步骤1)主要包括以下步骤：a.茶尺蠖核型多角体病毒的分离纯化；b.将纯化的茶尺蠖核型多角体病毒作为抗原对小鼠进行免疫；c.细胞融合和克隆：在加强免疫3天后取小鼠脾细胞和正处于对数生长期的骨髓瘤细胞在PEG6000的作用下进行细胞融合，每次融合后，将细胞接种于96孔培养板，用含HAT的1640完全培养基选择培养10天，然后将HAT改为HT培养1周；待细胞长至显微镜视野的1/4，取培养上清用ELISA法检测抗体，以茶尺蠖核型多角体病毒作为包被原对所选阳性细胞进行再筛选，选择最终的阳性细胞以有限稀释法进行克隆；d.对检测为阳性单克隆细胞株进行传代培养，筛选出阳性单克隆抗体细胞株；e.杂交瘤细胞腹水效价测定；f.单抗对病毒蛋白特异性识别；所述的步骤2)主要包括以下步骤：a.将待检样品置于包被液中，按每孔100μL加入酶联板的小孔中，设置对照，37℃下包被3-4h或4℃冰箱包被过夜；b.用1×PBST洗涤3次，每次5min；c.加150μL重量百分浓度为2％-5％的脱脂奶粉，37℃下封闭1h；d.配制茶尺蠖核型多角体病毒单克隆抗体于2wt％-5wt％脱脂奶粉中，体积配比为1∶1000，每孔加100μL，37℃下温浴1h；e.用1×PBST洗涤3次，每次5min；f.用1×PBST将辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠稀释5000倍，每孔加100μL稀释后的抗体，37℃下温育1h；g.用1×PBST洗涤3次，每次5min；h.加100μL显色液，37℃下温育3-5min；i.加50μL终止液；j.用酶标仪测读各孔在λ＝492nm处的光密度值OD，计算P/N＝样品OD值/对照OD值，若P/N≥2.1，即为阳性。