[发明专利]沉默食管癌细胞HIF-1α基因29ShRNA表达载体的构建

摘要

本发明公开了一种沉默食管癌细胞HIF-1α基因29shRNA表达载体的构建，依据NCBI数据库获得的HIF-1α基因ID，利用WHITEHOUSE，SiDirect和RationalsiRNA Design软件预测设计siRNA干扰序列，并利用BLAST分析干扰序列与人类全基因组的同源性；将siRNA序列转换成编码shRNA的DNA序列后克隆入pENTRTM/H1/TO载体，成功构建HIF-1α基因shRNA表达载体，并能有效抑制食管癌细胞HIF-1α的表达，为以HIF-1α为靶标的食管癌新药开发和基因治疗提供了新材料。

主权项

一种沉默食管癌细胞HIF-1α基因29ShRNA表达载体的构建，其特征在于：包括下述步骤：(1)根据NCBI获取NM_001530.3，设计正义链5’CTACTCAGGACACAGATTTAGACTTGGAG3’的29寡核苷酸干扰序列；(2)以pENTR/H1/TO为载体，依据质粒的插入位点和接头结构设计编码shRNA的单链DNA oligos，在正义链序列5’加入连接序列CACCA，中部加入loop环(GAGA)结构，反义链5’端加AAAA连接序列，3’端加T；设计最终连接的编码shRNA的DNA序列为正向：CACCA CTACT CAGGA CACAG ATTTA GACTT GGAGG AGACT CCAAGTCTAA ATCTG TGTCC TGAGT AG，反向：AAAAC TACTC AGGAC ACAGA TTTAG ACTTG GAGTCTCCTC CAAGT CTAAA TCTGT GTCCT GAGTA GT；(3)单链DNA oligos退火生成双链oligos，双链oligo连接pENTRTM/H1/TO载体，按照20μl反应体系进行连接反应，室温孵育5min，冰浴并转化感受态E.coli，用含50mg/l卡那霉素琼脂平板筛选阳性克隆；扩大培养阳性菌并提取得到pENTRTM/H1/TOhif-1α的重组质粒。