[发明专利]以兔膝关节软骨单位为种子细胞,体外构建组织工程软骨的实验方法

摘要

本发明属于组织工程化软骨体外构建的技术领域，具体涉及一种以兔膝关节软骨单位为种子细胞，体外构建组织工程软骨的实验方法。其步骤如下：留取兔膝关节，将关节软骨反复剪成碎片组织，冲洗，弃上清，放置于无菌锥形瓶备用；采用dispase酶和II型胶原酶按12mL DMEM-F12培养液/g软骨加入上述锥形瓶内，搅拌，消化，形成消化悬液；将消化悬液过滤、离心，加入原代软骨细胞培养液，制成无菌的软骨单位悬液，获得的软骨单位进行海藻酸钠凝胶立体培养构建组织工程软骨。本发明的有益效果：软骨单位体外长期培养过程中形态、增殖情况稳定，分泌II型胶原等基质成分生理学功能提高，有望促进组织工程法修复软骨损伤的效果。

主权项

一种以兔膝关节软骨单位为种子细胞，体外构建组织工程软骨的实验方法，其特征在于步骤如下：(1)、无菌条件下留取兔膝关节，在超净工作台内将膝关节打开，刮取膝关节股骨和胫骨平台全层软骨，将关节软骨反复剪成碎片组织，无菌D-Hanks液冲洗，弃上清，称重，放置于无菌锥形瓶备用；(2)、采用dispase酶和II型胶原酶按12mL DMEM-F12培养液/g软骨加入上述锥形瓶内，即每克软骨加入DMEM-F12培养液12mL，DMEM-F12培养液中含有质量/体积浓度为0.3％的dispase酶和质量/体积浓度为0.2％的II型胶原酶，上述两种酶均采用无菌DMEM-F12培养液溶解，经过0.22μm一次性过滤器过滤、除菌，加入培养液的锥形瓶放置于37℃5％CO2培养箱中磁力搅拌器上，慢速搅拌，进行联合酶解搅拌消化3h，形成消化悬液；(3)、将上述消化悬液用100μm细胞筛网过滤于离心管中，1200rpm离心5min，弃上清，然后10mL无菌DMEM-F12培养液反复冲洗、离心3次，加入原代软骨细胞培养液10mL，原代软骨细胞培养液包括DMEM-F12培养基9mL及肽牛血清1mL，制成无菌的软骨单位悬液，即获得了种子细胞——软骨单位；(4)、上述获得的软骨单位进行海藻酸钠凝胶立体培养，体外构建组织工程软骨，步骤如下：①、将120mg海藻酸钠粉剂溶解于10mL0.9％NaCl溶液，振荡，混匀，0.45μm一次性过滤器过滤、除菌备用，②、将软骨单位悬液计数、离心，弃上清，按4×106个单位/mL海藻酸钠凝胶混合，用无菌吸管反复吹打均匀，③、用微量移液器吸取40μL混合均匀的海藻酸钠凝胶，缓慢滴入无菌102mMCaCl2溶液，静置5～10分钟，制成海藻酸钠凝胶球，0.9％NaCl溶液蘸洗，接种于6孔板培养，每孔接种4粒凝胶球，加入原代培养基3mL，原代培养基包括DMEM-F 12培养基2.7mL及肽牛血清0.3mL，④、将培养板放置于37℃5％CO2培养箱进行培养，2～3日更换1次培养液，使关节软骨单位在海藻酸钠凝胶稳定生长。