[发明专利]猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法、抗体及应用

摘要

本发明公开了猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法、抗体及应用。本发明以超离纯化的猪圆环病毒II型作为免疫原，按常规方法免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0细胞融合，经间接ELISA筛选获得了2株分泌PCV2-Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为8-60、10-48，对其生物学特性进行鉴定，并将其作为一抗，建立了间接免疫荧光诊断方法。该间接免疫荧光诊断方法，与PCR诊断方法的结果基本一致，阳性和阴性符合率分别为93.75％和100％，为预防和治疗猪圆环病毒病提供了参考。

主权项

一种猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法，其步骤如下：(1)将冻存的PCV2复苏后扩大培养，超速离心，收集沉淀，超声波裂解，蛋白含量测定仪测定其质量浓度，-70～80℃冻存备用；(2)取健康7～8周龄BALB/c小鼠数只，颈背部皮下多点注射免疫，其中抗原PCV2全病毒剂量为首免100μg，二免100μg，三免180μg，免疫间隔14天，三免14天后尾静脉采血测抗体效价，选效价高数量级在107以上的小鼠在细胞融合前3天脾脏注射50μg加强免疫，(3)无菌摘取小鼠脾脏，制成脾细胞，按1∶5的体积比比例取脾细胞和骨髓瘤细胞混合，离心后，弃上清液；缓慢加入体积分数50％PEG 4000进行融合；用体积分数1％HAT培养液重悬融合细胞，加至96孔培养板中，每孔105个细胞/100μL，置CO2培养箱中培养，每天记录细胞生长情况；(4)待96孔板中有融合细胞生长，且液体稍微变黄时，吸取培养液，用包被Cap蛋白的间接ELISA方法进行筛选，选择强阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆；经几次亚克隆后，即获得稳定分泌猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体且效价高的杂交瘤细胞。