[发明专利]猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法、抗体及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体，特别是一种猪圆环 病毒II型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法、抗体及其应用。

背景技术

近年来新出现的断奶后仔猪多系统衰竭综合症(Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)是一种以发烧、渐进性消瘦、呼吸和 消化系统紊乱为特征的猪病，目前多个国家和地区存在该病的流行，给养猪业 造成了巨大的经济损失。猪圆环病毒II型(Porcine circovirus type 2，PCV2) 被认为是PMWS的主要病原，此外其还与多种其他猪病有关，如猪呼吸道病综合 症、猪皮炎肾病综合症等。

目前，国内外许多学者已经建立了多种诊断方法来检测猪圆环病毒2型及 其抗体，例如检测病原的多聚酶链式反应(PCR)技术、原位杂交方法、免疫组 化方法等和检测抗体的间接免疫荧光技术、酶联免疫吸附实验(ELISA)方法等， 但这些诊断方法有诊断周期长、成本高等局限性，不太适用于临床诊断的快速、 普及应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处而提供一种可用于建立一种 特异、敏感和快速的间接免疫荧光诊断方法来检测猪圆环病毒II型的猪圆环病 毒II型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法。

本发明的另一目的还在于提供一种由上述制备方法生产的猪圆环病毒II型 Cap蛋白单克隆抗体。

本发明的再一个目的还在于提供一种由上述方法制备的猪圆环病毒II型 Cap蛋白单克隆抗体的应用。

本发明的猪圆环病毒II型蛋白单克隆抗体的制备方法，其步骤如下：

(1)将冻存的PCV2复苏后扩大培养，超速离心，收集沉淀，超声波裂解， 蛋白含量测定仪测定其质量浓度，-70℃～80℃冻存备用；

(2)取健康7～8周龄BALB/c小鼠数只，颈背部皮下多点注射免疫，其中抗原 PCV2全病毒剂量为首免100μg，二免100μg，三免180μg，免疫间隔14天， 三免14天后尾静脉采血测抗体效价，选效价高数量级在10⁷以上的小鼠在细胞 融合前3天脾脏注射50μg加强免疫，

(3)无菌摘取小鼠脾脏，制成脾细胞，按1∶5的体积比比例取脾细胞和骨髓 瘤细胞混合，离心后，弃上清液；缓慢加入体积分数50％PEG 4000进行融合； 用体积分数1％HAT培养液重悬融合细胞，加至96孔培养板中，每孔10⁵个细 胞/100μL，置CO₂培养箱中培养，每天记录细胞生长情况；

(4)待96孔板中有融合细胞生长，且液体稍微变黄时，吸取培养液，用包被 Cap蛋白的间接ELISA方法进行筛选，选择强阳性孔采用有限稀释法进行亚克 隆；经几次亚克隆后，即获得稳定分泌猪圆环病毒II型Cap蛋白单克隆抗体且 效价高的杂交瘤细胞。

所述的制备方法还包括将取10周龄健康BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体 石蜡0.5mL/只，7～14d后腹腔注射杂交瘤细胞0.5mL(含5×10⁵～1×10⁶个杂 交瘤细胞)/只，待小鼠腹腔明显增大时抽取腹水，去除油脂和沉淀后即为单抗 腹水，-70℃～80℃冻存备用。

将所获得的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，可从其腹水中获得大量该单克隆抗体。

所述的制备方法步骤1中的超离离心的转速为55,000r·min^-1离心4h。

所述的制备方法步骤1中还包括在离心后采用适量的PBS溶解。