[发明专利]紫外分光光度计测定嘌呤的方法

摘要

本发明提供一种紫外分光光度计测定嘌呤的方法。步骤包括：准确称取0.5克充分干燥(用冻干机干燥)的食糜样本，置于25ml具塞带刻度的试管内；加入2.5ml高氯酸，放在90～95℃的恒温水浴内培养1小时；再加入17.5ml乙酸缓冲液，重新置于90～95℃的恒温水浴内培养10～15分钟，然后过滤；取0.5ml滤液转移到容积为15ml的离心管内，于4000rpm离心15分钟；放在90～95℃的恒温水浴内培养30分钟；用紫外分光光度计于260nm处比色，测得的嘌呤浓度用RNA当量表示；本发明操作简便，重复性高，数值准确，通过紫外分光光度计测定食糜中嘌呤含量，确定十二指肠食糜中微生物蛋白的含量，为确定奶牛代谢蛋白质含量提供方法学基础。

主权项

一种紫外分光光度计测定嘌呤的方法，其特征在于：步骤如下：步骤一：准确称取0.5克充分干燥(用冻干机干燥)的食糜样本，或分离所得的食糜微生物部分样本，置于25ml具塞带刻度的试管内，注意：样本必须是干燥的，否则会导致核酸水解不完全；步骤二：加入2.5ml高氯酸(HClO4，1M)，紧盖瓶口，然后将其放在90～95℃的恒温水浴内培养1小时，此时样本即炭化，形成黑色硬结，将硬结破碎，以利反应完全；步骤三：再加入17.5ml乙酸缓冲液(NH4H2PO4，0.0285M)，充分摇动，紧盖瓶口，重新置于90～95℃的恒温水浴内培养10～15分钟，然后通过Whatman 4号滤纸过滤，此时滤液的pH值为2左右；步骤四：取0.5ml滤液转移到容积为15ml的离心管内，分别加入0.5ml AgNO3(0.4M)和9ml甲种pH缓冲液(NH4H2PO4，0.2M)，然后置于暗处至少30分钟，最好是将其放置过夜(5℃)，可提高分析的准确度；步骤五：于4000rpm离心15分钟，然后小心地弃去上清液，注意不要搅动瓶底的沉淀物；步骤六：用pH为2的蒸馏水洗离心分离所得沉淀物一次，用与步骤五同样的方法离心，弃去上清液；步骤七：加入10ml 0.5N的盐酸溶液，充分摇动，使其与沉淀物混匀为止；步骤八：用具塞密封离心管，放在90～95℃的恒温水浴内培养30分钟；步骤九：用紫外分光光度计于260nm处比色，测得的嘌呤浓度用RNA当量表示；步骤十：酵母RNA标准曲线的制定：准确称取0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.40，0.50克酵母RNA，分别置于8个25ml的具塞带刻度的试管内，按上述分析样本内嘌呤含量的操作方法进行处理，最后于260nm处比色；步骤十一：数据统计分析采用SAS 2003ANOVA进行多重比较。