[发明专利]一种用于检测叶绿素a的化学发光方法

摘要

本发明公开了一种利用铁氰化钾-鲁米诺体系流动注射化学发光测定叶绿素a的分析方法。它包括流动注射化学发光分析系统试验参数的优化和铁氰化钾-鲁米诺体系测定叶绿素a的方法建立等过程，利用该方法可以测定叶绿素a，不能测定叶绿素b。叶绿素a质量浓度在0.5-10.0mg/L的范围内与增敏率呈良好的线性关系，其回归方程为：I＝23.244C-4.2218(R²＝0.9991)，方法的检出限为0.13mg/L。对浓度为5.0mg/L的叶绿素a标准溶液进行了11次平行测定的精密度试验和分为6份进行测定的重复性试验，其RSD分别为1.17％和3.74％。本发明可快速、灵敏地检测叶绿素a。

主权项

1.一种用于检测叶绿素a的化学发光方法，其特征在于具体步骤为：(1)流动注射化学发光分析系统的流路：反相流动注射化学发光分析系统的流路，R1、R2、R3三个管道分别泵入铁氰化钾、叶绿素a或空白作为检测液以及鲁米诺溶液；以检测液与鲁米诺溶液为载流，先经三通管混合，待基线稳定后，将铁氰化钾溶液注入到检测液与鲁米诺溶液充分反应后的合并流中，铁氰化钾的进样时间为20s，分别记录空白信号强度I0，样品信号强度为Is，相对发光强度为ΔI＝Is-I0，增敏率用I％表示，I％＝(IS-I0)/I0×100，以I％进行定量；(2)试验参数的优化：以5mg/L的叶绿素a溶液为试验对象，选择NaOH、铁氰化钾和鲁米诺为试验因素，根据单因素实验确定：NaOH浓度为4.0×103mg/L～4.0×104mg/L即0.1mol/L～1mol/L，铁氰化钾浓度为3.2925mg/L～3.2925×102mg/L即1×10-5mol/L～1×10-3mol/L，鲁米诺浓度为11.716×10-2mg/L～11.716mg/L即1×10-6mol/L～1×10-4mol/L；(3)铁氰化钾-鲁米诺体系测定叶绿素a的流动注射-化学发光分析方法的建立：①标准曲线的绘制：为提高检测精密度，在优化后的最佳试验因素水平条件下，以叶绿素a的浓度在0.5-10.0mg/L范围绘制标准曲线；②最低检测限的确定：通过多次样品空白试验，求得其背景响应的标准差，将三倍空白标准差作为检测限的估计值；然后配制相应检测限浓度的样品，实际测试来验证方法的最低检测限，最终测定结果为0.13mg/L；③精密度试验：对5mg/L的叶绿素a标准品溶液重复测定11次，计算其测定浓度的RSD为1.17％；④重复性试验：将1份5mg/L的叶绿素a标准品溶液分为6份，分别测定其浓度，计算其RSD为3.74％；⑤干扰试验：为了评价所建立分析方法的选择性，在已优化的试验条件下，考察了叶绿素a提取液中可能共存的组份对叶绿素a含量测定的干扰；由于样品经过分离提纯，所得叶绿素a提取液中可能共存的组分基本上只有少量的色素，据此，考察了叶绿素b、叶黄素和类胡萝卜素对试验的干扰，结果表明这些物质的实际含量均低于允许量，因此可直接测定；⑥样品分析：准确称取50-100g洗净晾干的植物叶片，加入体积百分比浓度为80％的丙酮500mL，超声震荡30min并浸泡过夜，于低温下抽滤后，量准上清液体积，按二氧六环∶丙酮抽提液为1∶7的体积比例加入二氧六环，然后再按水∶丙酮抽提液为1∶6的体积比例，在搅拌的情况下逐滴加入蒸馏水，直到出现沉淀，放在-20℃冰箱静置30min，并以1500×g离心5min，得到深蓝黑色的粉末状叶绿素a和叶绿素b的混合物沉淀，将沉淀溶于60mL无水乙醇，抽滤，除去难溶物，低温减压干燥成粉后溶于30mL体积百分比浓度为80％的丙酮，测定时取出1mL再定容至100mL作为样品溶液，按实验所述方法测定其含量；测得样品溶液浓度为7.93mg/L，RSD％为1.1％，重复6次，计算出从50-100g的植物叶片中提取出叶绿素a为23.8mg；同时进行加标回收率试验，测得回收率为97.63％～98.32％，，共存组份对测定无干扰。