[发明专利]一种耐热紫花苜蓿的转基因培育方法

摘要

本发明涉及一种耐热紫花苜蓿的转基因培育方法，其特征在于包括以下步骤：取主栽紫花苜蓿品种的子叶为外植体，诱导愈伤组织，继代培养至快速增殖期，暗条件预培养，进行农杆菌共培养转化，转移到筛选培养基进行3轮筛选，取抗性愈伤组织诱导分化成苗，对抗性植株进行组织化学染色和分子检测，鉴定含目的基因的分化小苗，对入选的转基因植株进行耐热性鉴定，选留不受热害、生长良好的转基因植株，继续种植室内外评价验证耐热性的表达稳定性，对稳定的优良株系进行种子繁殖，培育能正常越夏的耐热紫花苜蓿。本发明的耐热紫花苜蓿，更适合在我国南方种植，增加优质饲草的供应。

主权项

1.一种耐热紫花苜蓿的转基因培育方法，其特征在于包括以下步骤：1)取主栽紫花苜蓿品种的子叶为外植体，接种至诱导培养基，在25℃光条件下诱导形成愈伤组织；2)取诱导形成2周的愈伤组织，转移至继代培养基，继代培养至愈伤组织进入快速增殖期；3)取快速增殖的愈伤组织，在25℃暗条件下进行受体愈伤组织预培养3天；4)取预培养的愈伤组织，在农杆菌悬浮液中浸泡15分钟，之后弃去菌液，用无菌滤纸吸干，接种于共培养基上，在23℃暗条件下共培养3天；5)取共培养愈伤组织，洗净、晾干后，转移到筛选培养基，在25℃暗条件下培养2周，收集新长出的抗性愈伤组织，转移至新的筛选培养基上，再进行连续2轮继代筛选，每隔2周转继1次；6)取3轮筛选后的抗性愈伤组织，转移至分化培养基，诱导分化成苗，对抗性植株进行葡糖苷酸酶基因组织化学染色和分子检测，选留含目的基因的转基因植株；7)取入选的转基因植株，转移至温度35℃和光照10000Lux下耐热鉴定1周，移至自然环境生长1周，尔后重新置于35℃和10000Lux下再耐热鉴定1周，选留叶片不枯黄、生长良好的转基因植株，进行种子繁育；8)继续种植步骤7)筛选的转基因株系，室内外评价验证耐热性的表达稳定性，对稳定的优良株系进行种子繁殖，培育能正常越夏的耐热紫花苜蓿。