[发明专利]一种耐热紫花苜蓿的转基因培育方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种耐热紫花苜蓿的转基因培育方法。

背景技术

苜蓿因其高产、优质、利用年限长、根系发达，可改良土壤结构，增加土壤肥力，被誉为“牧草之王”。在我国，随着农业产业结构和畜牧业结构的调整，节粮型畜牧业，特别是草食动物养殖业，呈现良好的发展态势，因为苜蓿在提高奶牛、肉羊的单产中发挥决定性的作用，已成为我国“三元”种植结构调整的首选饲料作物，苜蓿产业作为新兴的朝阳产业，存在着广阔的发展空间。

由于夏季高温的原因导致紫花苜蓿在我国南方难以种植，南方的苜蓿干草基本是从北方调运，运输成本极高，既提高了饲养成本，而且质量难以保证，极大阻碍了南方草食畜禽的发展。CBF基因是几年前发现的一类耐逆相关基因，其所编码的转录激活因子能与CRT/DRE的DNA调控元件特异结合，促进启动子中含有这一调控元件的多个热和干旱诱导基因的表达，从而引起植株耐热性和耐逆性的增强。

正是在该背景下，本发明提出一种耐热紫花苜蓿的转基因培育方法，旨在培育更适合南方种植的耐热紫花苜蓿新品种，推动南方紫花苜蓿苜蓿产业化发展，增加优质饲草的供应。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐热紫花苜蓿的转基因培育方法，以获得适合南方种植的耐热紫花苜蓿新品种。

耐热紫花苜蓿的转基因培育方法，其特征在于包括以下步骤：

1)取主栽紫花苜蓿品种的子叶为外植体，接种至诱导培养基，在25℃光条件下诱导形成愈伤组织；

2)取诱导形成2周的愈伤组织，转移至继代培养基，继代培养至愈伤组织进入快速增殖期；

3)取快速增殖的愈伤组织，在25℃暗条件下进行受体愈伤组织预培养3天；

4)取预培养的愈伤组织，在农杆菌悬浮液中浸泡15分钟，之后弃去菌液，用无菌滤纸吸干，接种于共培养基上，在23℃暗条件下共培养3天；

5)取共培养愈伤组织，洗净、晾干后，转移到筛选培养基，在25℃暗条件下培养2周，收集新长出的抗性愈伤组织，转移至新的筛选培养基上，再进行连续2轮继代筛选，每隔2周转继1次；

6)取3轮筛选后的抗性愈伤组织，转移至分化培养基，诱导分化成苗，对抗性植株进行葡糖苷酸酶基因组织化学染色和分子检测，选留含目的基因的转基因植株；

7)取入选的转基因植株，转移至温度35℃和光照10000Lux下耐热鉴定1周，移至自然环境生长1周，尔后重新置于35℃和10000Lux下再耐热鉴定1周，选留叶片不枯黄、生长良好的转基因植株，进行种子繁育；

8)继续种植步骤7)筛选的转基因株系，室内外评价验证耐热性的表达稳定性，对稳定的优良株系进行种子繁殖，培育能正常越夏的耐热紫花苜蓿。

上述的稳定性是指入选紫花苜蓿的耐热性可在不同年份间(2年及以上)、季节间(2季及以上)以及地点间(2个地点及以上)表达一致，特性不受年份、季节以及地点的显著影响。

本发明中，所说的诱导培养基为MS基本培养基添加NAA5mg、BA0.5mg、蔗糖30g、琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。

本发明中，所说的继代培养基为MS基本培养基添加NAA0.5mg、BA2mg、蔗糖30g、琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。

本发明中，所说的共培养基为MS基本培养基添加NAA0.5mg、BA2mg、蔗糖30g、琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。

本发明中，所说的筛选培养基为MS基本培养基添加潮霉素100mg、NAA0.5mg、BA2mg、蔗糖30g、琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。

本发明中，所说的分化培养基为MS基本培养基添加KT1mg、蔗糖30g、琼脂粉6.8g，pH灭菌前5.8。