[发明专利]一种心律失常动物模型建立的方法

摘要

本发明提供了一种心律失常动物模型建立的方法。首先构建pBluescript-miR328质粒，建立miR-328转基因小鼠模型，然后提取与筛选gDNA，进行总RA提取，按逆转录试剂进行逆转录获得cDNA，以miR-328筛选引物对其表达进行分析，建立心律失常的小鼠模型。本发明的有益效果在于建立了一种可稳定遗传的心律失常模型，为后续的心律失常研究及药物筛选提供动物模型。该模型具有可稳定遗传，心率失常出现较早，对机体是长期作用，符合临床心律失常的作用特点。

主权项

一种心律失常动物模型建立的方法，其特征在于它包括以下步骤：(1)构建pBluescript‑miR328质粒：选取Pubmed上C57BL/6J小鼠Pre‑miR328序列，以基因组为模板，利用含Sal I和Hind III酶切位点的克隆引物，经PCR扩增获得含有该前体序列及其上下游侧翼序列；Sal I和Hind III酶切上述PCR产物与pBluescript载体，CIP对载体去磷酸化，纯化后，经T4连接酶将二者连接，连接产物转化入感受态细胞DH5α，确定重组质粒pBluescript‑miR328；(2)建立miR‑328转基因小鼠模型：以Spe I双酶切上述重组质粒，电泳胶回收获得纯化的显微注射用转基因构件，该构件包括心肌特异启动子α‑MHC、pre‑miR‑328、侧翼序列和转录终止信号；选取雌性B6小鼠将全部输卵管依次置于含透明质酸酶的胚胎培养液中分离受精卵，进行体外培养，将经显微注射后成活的受精卵移植于见栓雌性ICR小鼠的输卵管壶腹部，待雌性ICR小鼠分娩；(3)提取与筛选gDNA：将乳鼠尾尖置于消化液中，加入PCI、异丙醇，以70％乙醇溶液冲洗沉淀，加入170uL1×TE，震荡混匀，以gDNA为模板，用miR‑328筛选引物扩增转基因片段；(4)总RNA的提取与RT‑PCR：按Trizol试剂说明进行总RA提取，按逆转录试剂说明进行逆转录获得cDNA，以miR‑328筛选引物对其表达进行分析；(5)建立心律失常的小鼠模型。