[发明专利]染色体无标记随机整合载体pUTTns及其应用

摘要

本发明涉及染色体无标记随机整合载体pUTTns及其应用，属于生物工程技术领域。pUTTnsKm、pUTTnsCm和pUTTnsTet分别为含卡那霉素、氯霉素和四环素抗性基因的载体。该系列载体可通过转座子Mini-Tn5将外源基因随机整合到G-细菌染色体上，先通过抗性基因筛选整合子，再通过同向重复序列之间的重组将抗性基因删除，用反筛选标记基因sacB将抗性基因删除的重组子筛选出来，构建出无外源抗性基因标记的工程菌株。本发明载体具有使用范围广、能多次整合外源基因、操作简单方便等优点，所构建工程菌株遗传稳定、不含外源抗性基因、生态安全性高，为生态安全型基因工程菌构建提供了新的方法和技术平台。

主权项

染色体无标记随机整合载体pUTTns，其特征在于，由以下方法构建而成的：分别取含质粒pUT mini-Tn5和pWSMK的大肠杆菌，划线于含50mg/kg卡那霉素、100mg/kg氨苄青霉素的LB平板和含50mg/kg卡那霉素的LB平板，37℃培养24h，分别挑单菌入含相应抗生素的LB液体试管，37℃150rpm培养18h，碱裂解法提取质粒pUT mini-Tn5和pWSMK，用限制性内切酶SacI对质粒pUT mini-Tn5进行单酶切，回收片段；采用PCR扩增的方法从pWSMK中扩增出SacB基因并在其两端引入酶切位点SacI，酶切酶连将SacB基因整合进pUT mini-Tn5的SacI酶切位点中，挑选阳性克隆命名为pUTTnSacBs；将pUTTnSacBs用SphI和NotI双酶切，回收大片段，采用PCR扩增的方法从pUTTnSacBs中扩出SacB基因的前四百个碱基，命名为SacBq400，两端引入酶切位点SphI和NotI，同时在NotI酶切位点前引入多克隆位点ApaI、NcoI、NdeI、AcccIII、EcoO109、PspOMI和BspEI，酶切酶连将SacBq400整合入pUTTnSacBs，转化E.coli DH5αλpir，即为构建成功pUTTnsKm；将pUTTnsKm用MluI酶切，将卡那霉素抗性基因从pUTTnsKm中切开，回收大片段，采用PCR扩增法获得氯霉素抗性基因和四环素抗性基因，两端引入MluI限制性内切酶酶切位点，通过酶切酶连，分别连入pUTTnsKm用MluI酶切回收的大片段中，转化E.coli DH5αλpir，挑选阳性克隆即分别为pUTTnsCm和pUTTnsTet；pUTTnsKm、pUTTnsCm和pUTTnsTet分别为含卡那霉素、氯霉素和四环素抗性基因的整合载体系列，该载体通过同向序列的设计，可最终将抗性基因删除；pUTTnsKm载体保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其宿主为大肠杆菌Escherichia coli DH5αλpir，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏号为：CGMCC3098。