[发明专利]极细枝孢霉生物合成茶黄素粗提物的方法

摘要

一种极细枝孢霉(Cladosporium tenuissimum)生物合成茶黄素(Theaflavins，TFs)粗提物的方法，通过对大量微生物进行筛选，获得多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，PPO)的高产菌株极细枝孢霉，在优化的发酵培养基中于pH为4.5－5.3、摇床转速为110－130r/min、温度为22－25℃的条件下恒温培养该菌株合成多酚氧化酶，取得多酚氧化酶粗酶液，并通入氧气进行体外模拟氧化儿茶素40－50分钟制备茶黄素。应用本发明可以获得茶黄素粗制品中茶黄素含量高于20.00％，且工艺步骤简单，设备投入少，工效高，生产成本低；反应过程中不使用任何有机溶液，是一种绿色环保的茶黄素生产方法。

主权项

1、一种极细枝孢霉生物合成茶黄素粗提物的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)、多酚氧化酶粗酶液的制备：a、菌种的筛选：a1：菌种的初筛：从茶园10-20cm深处取土，每克土样加入19ml的无菌水，并加入玻璃珠，振摇4-6min，稀释1000倍，取0.2ml接种于上层为PDA固体，下层为每10.0ml的PDA加0.02g儿茶素的固体初筛培养基平板上，将平板置于28℃恒温培养箱中，静置培养3天；a2：菌种的复筛：将初筛培养基上有氧化圈的菌株划线接种到每10.0ml的PDA加0.02g儿茶素的固体纯化培养基平板上进行培养，直至得到纯化的极细枝孢霉菌株；b、菌种的扩大培养：将a2步骤中纯化菌种转接种至每10.0ml的PDA含有0.02g大叶种茶儿茶素的液体培养基中，于22-25℃下，以转速为110-130r/min恒温振荡培养4天；c、发酵培养基的配制：配制马铃薯200g/L、葡萄糖5g/L、NH4NO3 3g/L、纯度大于70％的大叶种茶儿茶素3g/L、CuSO4 0.1mmol/L、FeSO4 0.1mmol/L的液体发酵培养基，培养液体积为容器总体积的50-65％，pH为4.5-5.3，于121℃条件下灭菌20min；d、菌种的接种与发酵：取b步骤中带有菌株的扩大培养基接种到c步骤中的发酵培养基中，接种量为扩大培养基∶发酵培养基(体积比)为4-7∶93-96，于22-25℃、转速为110-130r/min恒温振荡培养4天；e、制备粗酶液：取上述发酵培养液，用4层干净纱布过滤菌丝体，然后于3-5℃下，以离心转速为7800-8200r/min离心25-35min后，取上清液作为粗酶液；(2)、酶促氧化儿茶素制备茶黄素：取上述粗酶液，按每100ml粗酶液加入纯度大于70％的儿茶素2.0g，于温度为22-25、pH为4.5-5.3的条件下通入氧气以不产生大量气泡为宜，反应40-50分钟，将反应液用膜过滤浓缩冷冻干燥即得茶黄素粗制品。