[发明专利]极细枝孢霉生物合成茶黄素粗提物的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种微生物胞外酶生产茶黄素的方法，尤指一种极细枝孢霉(Cladosporium tenuissimum)生物合成茶黄素粗提物的方法。

背景技术：

茶黄素为红茶的主要活性物质，具有多种药理与保健功效，某些方面甚至优于儿茶素，在天然药物、功能食品、日用化工、功能饮料开发等领域有着广泛的应用前景。目前所利用的茶黄素主要是从红茶中分离提取，红茶中茶黄素(TFs)总量含量低，约为0.2％-2.0％，但存在分离纯化技术难度大，成本高的缺点，这些技术障碍严重阻碍了其开发利用。获取高含量、低成本的茶黄素已成为茶学界、食品界和医药界研究的重要课题。体外模拟氧化(包括酶促氧化和化学氧化)一直作为研究儿茶素氧化机理及红茶发酵理论简单、有效的方法，已有学者用此方法研究制备了茶黄素，并获得了较好的效果。体外氧化制备茶黄素与从红茶中萃取制备比较，成本要明显降低。目前体外氧化制备茶黄素主要是通过化学方法或通过酶法制备，但化学方法具有终点难以掌握、反应副产物多等缺点；酶法因存在酶源缺乏、酶活性低等问题而未能广泛应用。因此，寻找理想的酶源已是体外模拟氧化制备茶黄素的首要任务。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种极细枝孢霉(Cladosporium tenuissimum)生物合成茶黄素粗提物的方法，从茶黄素合成所需的多酚氧化酶酶源入手，利用微生物繁殖快、易培养、经济成本低等特点，筛选出高产多酚氧化酶的菌种应用于茶黄素的制备。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种极细枝孢霉(Cladosporium tenuissimum)生物合成茶黄素的方法，包括如下步骤：

(1)、多酚氧化酶粗酶液的制备：

a、菌种的筛选：

a₁：菌种的初筛：从茶园10-20cm深处取土，每克土样加入19ml的无菌水，并加入玻璃珠，振摇4-6min，稀释1000倍，取0.2ml接种于上层为PDA固体，下层为每10.0ml的PDA加0.02g儿茶素的固体初筛培养基平板上，将平板置于28℃恒温培养箱中，静置培养3天；

a₂：菌种的复筛：将初筛培养基上有氧化圈的菌株划线接种到每10.0ml的PDA加0.02g儿茶素的固体纯化培养基平板上进行培养，直至得到纯化的极细枝孢霉菌株；

b、菌种的扩大培养：

将a₂步骤中纯化菌种转接种至每10.0ml的PDA含有0.02g大叶种茶儿茶素的液体培养基中，于22-25下，以转速为110-130r/min恒温振荡培养4天；

c、发酵培养基的配制：

配制马铃薯200g/L、葡萄糖5g/L、NH₄NO₃ 3g/L、纯度大于70％的大叶种茶儿茶素3g/L、CuSO₄ 0.1mmol/L、FeSO₄ 0.1mmol/L的发酵液体培养基，培养液体积为容器总体积的50-65％，pH为4.5-5.3，于121℃条件下灭菌20min；

d、菌种的接种与发酵：

取b步骤中带有菌株的扩大培养基接种到c步骤中的发酵培养基中，接种量为扩大培养基∶发酵培养基(体积比)为4-7∶93-96，于22-25℃、转速为110-130r/min恒温振荡培养4天；

e、制备粗酶液：

取上述发酵培养液，用4层干净纱布过滤菌丝体，然后于3-5℃下，以离心转速为7800-8200r/min离心25-35min后，取上清液作为粗酶液。

(2)、酶促氧化制备茶黄素：

取上述粗酶液，按每100ml粗酶液加入纯度大于72％的儿茶素2.0g，于温度为22-25℃、pH为4.5-5.3的条件下通入氧气以不产生大量气泡为宜，反应40-50分钟，将反应液用膜过滤浓缩冷冻干燥即得茶黄素粗制品。该茶黄素粗提物中主要含四种茶黄素单体：TF、TF3G、TF3’G及TFDG。

如此，本发明通过对大量微生物进行筛选，获得多酚氧化酶的高产菌株极细枝孢霉，利用微生物天然酶源、安全、高效、低成本地制备茶黄素，茶黄素粗品中茶黄素总量高于20.00％；且工艺步骤简单，设备投入少，工效高，生产成本低；反应过程中不使用任何有机溶液，是一种绿色环保的茶黄素生产方法。

具体实施方式：

以下实施例中：