[发明专利]从重组人睫状神经营养因子及其突变体中分离异构蛋白的方法

摘要

本发明涉及一种从基因重组表达的蛋白中分离出异构蛋白的方法。本发明的方法是将收集的湿菌体在洗涤缓冲液制成菌体混悬液，经超声破碎离心，弃去上清，沉淀用含尿素、TritonX－100的TE缓冲液洗涤得到表达蛋白包涵体，再用含盐酸胍或是尿素的缓冲液将该包涵体充分溶解，将包涵体溶解液用含有Tris－HCl、精氨酸和EDTA缓冲液进行稀释复性，再放置24～48h，成为CNTF复性蛋白液，超滤浓缩后，经凝胶层析G－25柱转换至Tris缓冲液中，收集蛋白峰，再将转换了液体的CNTF复性蛋白液上Q Sephrose－Fast Flow阴离子交换柱，去除未复性好的CNTF蛋白及杂蛋白。

主权项

1.从重组人睫状神经营养因子及其突变体中分离异构蛋白的方法，其特征是将收集的湿菌体以1∶5～1∶10(W/V)的比例加入洗涤缓冲液，制成菌体混悬液，超声破碎至菌体完全破裂、包涵体溶出，再在8000×g～12000×g离心，弃去上清，将沉淀用含1～3mol/L尿素、0.5％TritonX-100的TE缓冲液充分洗涤，得到表达蛋白包涵体，再用含变性剂6mol/L的盐酸胍或是8mol/L的尿素的缓冲液将该包涵体充分溶解至蛋白含量为1～0.5mg/ml，得到包涵体溶解液，将包涵体溶解液用pH8.5，0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L精氨酸、1mmol/L EDTA的缓冲液进行稀释复性，直至目的蛋白的终浓度小于100μg/ml，变性剂的终浓度小于1mol/L；4℃放置24～48h，成为CNTF复性蛋白液，超滤浓缩后，经凝胶层析G-25柱转换至Tris.Cl缓冲液中，收集蛋白峰，上Q Sephrose-Fast Flow阴离子交换柱，去除未复性好的CNTF蛋白及杂蛋白；离子交换层析的上样缓冲液为：pH7.0～8.5，Tris-HCl，1mmol/L EDTA，解离缓冲液为：pH7.0～8.5，Tris-HCl，1mmol/L EDTA、含0.1～0.5mol/LNaCl，再将解离收集的目的蛋白上Octyl-4 Fast Flow疏水层析柱去除DNA及内毒素，疏水层析的条件为：A液为Tris-HCl，其pH7.0～8.5，含1mmol/L EDTA和0.1～0.5mol硫酸铵；B液为Tris-HCl，其pH7.0～8.5，含1mmol/L EDTA，用A液和B液梯度解离，收集蛋白峰后再上Superdex-75凝胶层析柱，所用缓冲液为pH7.0～8.0的磷酸缓冲液，收集目的蛋白峰，即为CNTF原液。