[发明专利]从动物血中分离三种酶(制剂)的联产工艺

摘要

本发明公开了一种简化工艺、避免用有机溶剂等化学方法、提高工艺效率和产品质量的从动物血中分离三种酶的联产工艺；本发明的方法，依次投料同时获得三种酶制剂：SOD、CAT和凝血酶，大大提高了血液的利用度。制备过程中采用离心、过滤、热变性等新思路，有效地将三种酶一一分开。

主权项

1. 一种从动物血中分离三种酶的联产工艺，其工艺步骤为：A.新鲜动物血加柠檬酸三钠抗凝剂，充分搅拌，通过离心机离心(3000rpm，30min)得血浆和血球。血浆提取凝血酶，血球提取SOD和CAT；B.凝血酶提取a.血浆加水稀释，用1％乙酸调节pH5.3，离心5-10min，离心弃去离心液，收集沉淀，的凝血酶原；b.分离、沉淀、洗涤：取凝血酶原溶于NaCl溶液中(0.9％)加入CaCl2 (1.5％)，搅拌10min，冷室放量1n，离心分离，沉淀为血纤维蛋白，溶液加等量丙酮，静置过应，沉淀用乙醚洗涤，真空干燥的粗制凝血酶；c.除杂质、沉淀、干燥，去粗酶溶于0.9％CaCl2溶液中，0℃放置6h过滤，然后用1％乙酸条pH至5.5，离心弃沉淀。清夜加工倍量冷丙酮，沉淀分别用乙醇、乙醚洗涤，真空干燥即得精致凝血酶；C.SOD和CAT混合液制备将血球加等体积0.9％NaCl溶液洗二次，获得了干净的红细胞，然后加等体积的去离子水溶血30min，溶血液加二价金属氯化物用于去除杂蛋白。65℃加热10min，离心的含SOD和CAT的粗酶液。然后用截留分子量10万的过滤膜将二酶分开，过滤流击液含分子量较小的SOD等蛋白，浓缩液含分子量较大的CAT等蛋白。过滤液备用分别用作提取SOD和CAT等酶的原料；D.SOD提取上述过滤清液加入0.3mol/L的CuCl2和ZnCl2溶液，充分混匀，然后用截留分子量10000的过滤膜浓缩至原体积的1/10~1/2的过滤浓缩液。热度性(65℃，10min)去杂蛋白，离心的清液，接着DEAE-SephadexA-50柱，即可得比活在5000u/(mg。蛋白)的高纯度SOD。SOD在液体中易失活，通常将其制成冻干粉；E.CAT的提取上述浓缩液，加等量0.3mol/L的溶液，充分搅拌，然后用截留10万分子量的过滤膜浓缩至原体积的1/2，重复二次。然后条pH至4.5，先进行等电点沉淀，然后加蛋白沉淀剂聚丙烯酸钠(PA)，离心弃沉淀(3000rpm，30min)，这样就可以得到CAT的精制溶液。在常温下，CAT易失活，通常在精制液中加0.5％Na2S2O3和3％的甘油保护剂，这样CAT的保存活力至少在半年以上。