[发明专利]人C－型利尿钠肽与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品

摘要

人C－型利尿钠肽(CNP)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效重组融合蛋白药物技术领域。本发明利用重叠PCR技术，将HSA cDNA和CNP cDNA进行拼接，中间不加入任何连接肽，得到的HSA－CNP cDNA融合基因被整合到宿主的染色体中，在宿主系统中进行表达。本发明的融合蛋白包括与人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区和与人C－型利尿钠肽至少85％序列同源的第二区，该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入。本发明的融合蛋白在保持了人C－型利尿钠肽的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，改善其溶解度，在药学领域有良好的应用前景。

主权项

1、人C-型利尿钠肽CNP与人血清白蛋白HSA的融合蛋白的制备方法，其特征是从人血管内皮细胞中提取RNA，通过RT-PCR反转录得到CNP cDNA；通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSA cDNA；用重叠PCR技术，连接HSA cDNA和CNP cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的HSA-CNP cDNA融合基因插入到克隆载体，HSA-CNP cDNA融合基因在宿主系统进行表达，HSA-CNP cDNA融合基因被整合到宿主的染色体中；(1)CNP cDNA的克隆：以RT-PCR反转录得到的CNP cDNA第一链为模板，通过PCR扩增出CNPcDNA，所用的引物如下：p1：5’CGGAATTCCACCATGCATCTCTCCCA-3’p2：5’AATGCGGCCGCCTAACATCCCAGGCCGCT-3’PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的p1和p2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，CNP cDNA第一链1μg，加双蒸水补齐50μl，PCR条件为：95℃变性10分钟，94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环35次；通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出0.5kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBluescriptIIKS(+)分别经EcoRI和NotI双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及EcoR I和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoR I和Not I双酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻存于-80℃；重组质粒命名为pBlue-CNP，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-CNP；(2)HSA cDNA的克隆：利用PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出HSA cDNA，所用的引物为：PH1：5’AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’PH2：5’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的PH1和PH2的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文库1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸90秒，循环30次；通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目标片段，纯化好的目标片段和载体pBluescriptIIKS(+)分别经SalI和HindIII双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及SalI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒SalI和HindIII双酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻存于-80℃；重组质粒命名为pBlue-HSA，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-HSA；(3)HSA cDNA和CNP cDNA融合基因的克隆：HSA cDNA的PCR扩增，所用引物如下：P1：5’-CGGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCG-3’P1：5’-AGCAGCTGGGAGAGATGCATGCCTAAGGCAGCTTGACTTGCAG-3’PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的引物P1和P2各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-HSA 1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性5分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，94℃变性1分钟，循环30次；CNP cDNA的PCR扩增，所用引物如下：P3：5’-CAAGTCAAGCTGCCTTAGGCATGCATCTCTCCCAGCTGCT-3’P4：5’-AATGCGGCCGCCTAACATCCCAGGCCGCTCATGGAGCC-3’PCR方法如下：50μl的反应体系中加入：10μmol/L的P3和P4的引物各1.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-CNP 1μg，加双蒸水补齐50μl；PCR条件为：95℃变性10分钟，56℃退火45秒，72℃延伸90秒，94℃变性1分钟，循环30次；利用重叠PCR融合CNPcDNA和HSA cDNA：将CNP的PCR扩增产物和HSA的PCR扩增产物以体积比1∶1比例混合后作为模板，在50μl的PCR反应体系中加入：2.5mmol/L的dNTP 4μl，10×pfuBuffer 5μl，5U/μl pfu DNA聚合酶1μl，混合好的模板2μl，双蒸水36μl；PCR条件为：95℃变性10min，65℃退火1min，72℃延伸4min30s，94℃变性1min，循环8次后，向反应体系中加入10μmol/L的P1和P4的引物各1μl，循环30次；通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出2.2kb的目标条带，纯化好的目标片段和载体pBluescriptIIKS(+)分别经EcoRI和NotI双酶切；琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，取双酶切后纯化好的pBlue-HSA-CNP片段5μl，pPIC9K 5μl，加入10×ligation buffer 2μl，T4连接酶0.4μl，加双蒸水补齐20μl，15℃反应过夜；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoRI和NotI酶切位点间区域进行DNA测序；阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻存于-80℃；重组质粒命名为pBlue-HSA-CNP，阳性重组子命名为DH5α/pBlue-HSA-CNP；(4)融合蛋白HSA-CNP的重组酵母构建：取一支冻存的DH5α/pBlue-HSA-CNP，接种到20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒，提取的质粒pBlue-HSA-CNP和酵母表达载体pPIC9K，分别经EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化，用PCR片段胶回收试剂盒回收，用T4连接酶连接两双酶切后纯化好的片段；取双酶切后纯化好的pBlue-HSA-CNP片段5μl，pPIC9K 5μl，加入2μl 10×ligationbuffer，0.4μl T4连接酶，加双蒸水补齐20μl，15℃反应过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜；挑取长出菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜，提取质粒；通过PCR，及EcoRI和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃；重组质粒命名为pPIC9K-HSA-CNP，阳性重组子命名为DH5α/pPIC9K-HSA-CNP；提取DH5α/pPIC9K-HSA-CNP中的质粒，经SalI酶切后，电击转化毕赤酵母KM71，提取重组毕赤酵母基因组DNA，通过PCR，琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性重组子命名为KM71/pPIC9K-HSA-CNP；(5)融合蛋白HSA-CNP的表达：将KM71/pPIC9K-HSA-CNP接种至装有100ml BMGY的500ml三角瓶中，300rpm，29℃培养至A600nm为2～6，离心收集菌体，将收集到的菌体接种至装有20ml BMMY的100ml三角瓶中，每24小时补加一次甲醇至终浓度0.5％(V/V)，诱导3天，离心收集上清，进行SDS-PAGE验证，Western杂交及放射免疫鉴定融合蛋白HSA-CNP分子的CNP的免疫源性。