[发明专利]人C－型利尿钠肽与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品

说明书

技术领域

人C-型利尿钠肽与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效重组融合蛋白药物技术领域。

背景技术

人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是血浆中的主要蛋白成分，在血浆中的浓度为40mg/ml(Phillip P.Minghettis et a1.，THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY，1986 261：6747-6757)，它除了具有维持血浆渗透压功能外，还能结合内源性和/或外源性配体，包括激素、有毒代谢产物、药物等。通过结合这些配体，HSA可以调节激素活性、内源性和/或外源性物质的毒性和药物的利用度(Ji-Sook Haet al.，Biochimica et Biophysica Acta，20031640：119-128)。David S.Park等构建的HalfHSA(截取HSA的前297个氨基酸残基)具有野生型HSA相应区类似的二级结构，同时保留了野生型HSA结合甲状腺素和甲状腺素类似物的能力(David S.Park et al.，IUBMB Life，1999 48：169-174)，细胞中刚翻译出来的人血清白蛋白具有典型的pre-pro-protein结构，包括18个氨基酸残基的信号肽和6个氨基酸残基前肽的原肽。信号肽和前肽在转运和分泌的过程中被切除，成熟的HSA由585个氨基酸残基组成，含有17对二硫键，分子量约为66.5KDa。通常情况下，HSA为非糖基化蛋白，然而有的突变体中也存在N一连接糖基化(见Uniprot中的protein ALBU HUMAN)。Peters的观点认为进化出大分子蛋白的优点是减小其在内循环时经肾排泄(Peters T.Jr.，Adv.Protein Chem.，1985 37：161-245)。HSA的分子量相对较大，在正常情况下，不易被肾小球滤过，其血浆半衰期在20天左右。

人C-型利尿钠肽(typc C natriutetic peptides，CNP)主要存在于中枢神经系统，由血管内皮细胞合成和分泌，通过与靶细胞的血管平滑肌细胞上的特异性NP-B受体结合，激活与质膜相连的鸟苷酸环化酶，促进第二信使cGMP积累，导致cGMP依赖蛋白激酶磷酸化，通过降低细胞内钙离子浓度，使血管平滑肌松弛，达到调节局部血管张力的作用，并阻止血管平滑肌增生。CNP是一种强的非内皮依赖性的外周静脉扩张剂，在许多神经系统疾病及其它疾病中的潜在作用价值越来越受到广泛重视。血浆中CNP浓度很低，以pg浓度存在，半衰期较短，约为2.6分钟，这些特性给CNP的药物化造成了很大的障碍，研究CNP的药物化，首先要改善它的稳定性，提高其生物利用度。为了克服上述缺点，可以对CNP加以修饰，以延长其半衰期。主要方法有做成缓释剂型、利用化学手段修饰(如用PEG，葡聚糖修饰)、利用基因工程手段将其与其它大分子蛋白融合。本发明将把CNP和HSA进行融合表达，通过研发人CNP的长效化技术，改善CNP体内药代动力学性状，研发出一种具有自主知识产权的长效新药。

发明内容

本发明的目的是提供一种人C-型利尿钠肽与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品。本发明的融合蛋白在保持了人C-型利尿钠肽的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域有良好的应用前景。

本发明的技术方案：从人血管内皮细胞中提取RNA，通过RT-PCR反转录得到CNP cDNA；通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSA cDNA；利用重叠PCR技术，连接HSA cDNA和CNP cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的HSA-CNP cDNA融合基因插入到克隆载体中保存；HSA-CNP cDNA融合基因在宿主系统进行表达，HSA-CNP cDNA融合基因被整合到宿主的染色体中。

CNP cDNA的克隆，HSA cDNA的克隆，HSA cDNA和CNP cDNA融合基因的克隆，融合蛋白HSA-CNP的重组酵母构建和融合蛋白HSA-CNP的表达的步骤详见实施例。

用上述方法制备的人C-型利尿钠肽与人血清白蛋白的融合蛋白，包括与人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区和与人C-型利尿钠肽至少85％序列同源的第二区；所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的N末端，所述与人C-型利尿钠肽同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述与人C-型利尿钠肽同源的第二区位于融合蛋白的N末端，所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。