[发明专利]抗重金属铅单克隆抗体的制备方法

摘要

本发明是重金属铅单克隆抗体的制备方法，属于生物技术领域。专用于特异性识别重金属铅的单克隆抗体的制备。重金属铅离子与载体蛋白通过双功能金属螯合剂对氨基苯基－二乙三胺五乙酸偶联获得完全抗原，经免疫Balb/C鼠，脾细胞和Sp2/0骨髓瘤细胞通过杂交瘤技术制备杂交瘤细胞，经筛选获得了稳定的分泌特异性强的抗铅单克隆抗体，该抗体只针对Pb－DTPA有抑制，而不与DTPA起反应。本发明抗原实用性强，抗原和抗体稳定性好。抗原制备技术简便可行：抗原的整个制备过程无需要特别的仪器设备，容易工厂化规模生产。

主权项

1、铅单克隆抗体的制备方法，包括：1)抗原制备：称取血蓝蛋白15mg溶于2ml 10mM，pH 7.4 N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液中形成7.5mg/ml血蓝蛋白溶液；称取双功能金属螯合剂对氨基苯基-二乙三胺五乙酸8mg溶于0.8ml超纯水形成金属螯合剂溶液；将0.8ml金属螯合剂溶液搅拌下逐滴滴加到2ml 7.5mg/ml血蓝蛋白溶液中，随后滴加0.2ml 20mM戊二醛室温下搅拌24hr；反应产物用30Kd的超滤管纯化，超滤管预先用100mM乙二胺四乙酸浸泡，用超纯水充分冲洗后，超滤管内加入反应产物超滤，超滤管内用10mM，pH 7.4N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液5次除去其中未反应的小分子金属螯合剂，所得产物即为纯化的血蓝蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸；30mg牛血清白蛋白溶于6ml pH为7.4、10mM的N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液，称取18mg对氨基苯-二乙三胺五乙酸溶于1.8ml超纯水中，取6ml含量为5mg/ml的牛血清白蛋白逐滴滴加到1.8ml的对氨基苯-二乙三胺五乙酸溶液中，同时加入5ml浓度为20mM的戊二醛溶液，室温下搅拌24hr；反应产物用上述30Kd的超滤管方法进行纯化除去其中未反应的小分子金属螯合剂，所得产物即为纯化的牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸溶液，将牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸溶液等分成两份，一份直接用作包被抗原，一份用于下面的反应；称取43.8mg含量为99.999％的铅颗粒溶于1ml优级6M硝酸中，形成212.6mM硝酸铅溶液；取99μl硝酸铅溶液搅拌下分别逐滴滴加到纯化过的血蓝蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸和牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸中，用0.5M盐酸调节pH至7.0，室温下反应3小时；反应产物用上述30Kd的超滤管方法进行纯化去除未反应的金属离子，纯化后的产物分别为血蓝蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb和牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb以所含蛋白进行计量为15mg铅的人工抗原含量的溶液，以血蓝蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb作免疫原，以牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb作为包被抗原；2)小鼠免疫：将制备好的血蓝蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb作为免疫原免疫6-8周龄雌性BalB/c鼠，每次每只小鼠的免疫原用量200μg，共免疫五次，前两次免疫间隔3周采用由等体积的抗原和佛氏完全佐剂乳化，腹腔注射，以后三次免疫间隔2周用等体积的佛氏不完全佐剂和免疫原乳化；从第四次开始，每次免疫后一周，鼠尾静脉采血用间接非竞争ELISA检测抗体的特异性，分别用相同浓度的牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸和牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb 50μl/孔包被96孔酶联微量分析板，4℃过夜或37℃放置2小时；用含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液稀释明胶至1％，100μl/孔，37℃放置1.5小时；含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；加入相同数量的血清37℃1小时；含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤6次；磷酸盐缓冲液溶液1000倍稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，50μl/孔，37℃1小时；含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤6次；四甲基联苯胺50μl/孔，37℃显色10分钟；加25μl/孔的2M硫酸终止反应，酶联仪上测450nm处吸光值，并计算差异％，差异％＝{牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb的吸光值-牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸的吸光值}/牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸的吸光值×100％；3)细胞融合通过差异率筛选BalB/c鼠，差异率超过50％的BalB/c鼠用N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸缓冲液稀释血蓝蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb直接免疫，三天后取脾脏，脾细胞和对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞通过杂交瘤技术制备杂交瘤细胞，37℃，5％二氧化碳培养箱培养10-14天后，通过检测融合孔上清筛选杂交瘤细胞；4)杂交瘤筛选：融合孔上清用上述筛选小鼠的间接非竞争ELISA法进行初步筛选，用相同浓度的牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸和牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb 50μl/孔包被96孔酶联微量分析板上，4℃放置过夜；用含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液稀释明胶至1％，100μl/孔，37℃放置1.5小时；含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；加入相同数量的融合孔上清50μl/孔，以空白孔调零，用SP2/0的上清作阴性对照，37℃1小时，含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤6次；加入磷酸盐缓冲液1000倍稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，50μl/孔，37℃1小时；含0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤6次；四甲基联苯胺50μl/孔，37℃显色10分钟；加25μl/孔的2M硫酸终止反应，酶联仪测450nm处吸光值，用血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb包被的成阳性而用牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸包被的孔的接近SP2/0的融合孔即为阳性孔；由于铅离子是小分子不具有免疫原性，单独的金属离子也足以形成抗原表位，作必须借助螯合剂二乙三胺五乙酸形成半抗原与抗体反应，为了进一步确定得到阳性孔所分泌抗体是针对金属铅而不与二乙三胺五乙酸反应，通过竞争ELISA进一步确定抗体的特异性，用牛血清白蛋白-对氨基苯基-二乙三胺五乙酸-Pb 50μl/孔包被酶标板，4℃放置过夜，0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；0.5％土温20的磷酸盐缓冲液稀释明胶至1％，100μl/孔，37℃1.5小时；0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次；各种浓度1，2，5，10，20，50mM二乙三胺五乙酸溶液与等体积的融合孔上清充分混匀室温反应45分钟，50μl/孔加入到酶联板上，37℃1小时；0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤6次；磷酸盐缓冲液溶液1000倍稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，50μl/孔，37℃1小时；0.5％土温20的磷酸盐缓冲液洗涤6次；四甲基联苯胺50μl/孔，37℃显色10分钟，加入25μl/孔的2M硫酸终止反应，酶联仪上450nm处读数，用不加乙二胺四乙酸的孔作阳性对照吸光值A0，加乙二胺四乙酸孔的吸光值A，若A＝A0，则A对应的加乙二胺四乙酸的浓度则为乙二胺四乙酸的最佳浓度，且所选乙二胺四乙酸浓度必须大于金属离子的最大浓度。