[发明专利]一种抗肿瘤融合蛋白的制备方法及其应用

摘要

一种抗肿瘤融合蛋白的制备方法及其应用，涉及一种融合蛋白。根据ProTα的基因序列，设计上下游引物P1和P2，P1引入BamHI酶切位点，P2引入EcoRI酶切位点。用RT-PCR方法得前胸腺素α原全长基因cDNA，PCR产物纯化后与pMD18-T Vector连接，转化DH5α感受态细胞，对7个单克隆基因序列和参考的proTα的基因序列比对。用EcoRI和BamHI双酶切ProTα PCR产物，将ProTα基因片断插入经同样双酶切的原核表达载体pGEX 6P-1中，转化大肠杆菌BL21，加入IPTG，诱导表达，菌液离心后的沉淀用上样缓冲液溶解，离心取上清电泳，得GST-Proα融合蛋白。

主权项

1.一种抗肿瘤融合蛋白的制备方法，其特征在于其包括以下步骤：1)根据ProTα的基因序列，设计上游引物P1和下游引物P2，上游引物P1和下游引物P2分别为：上游引物P1：5’-GCGGATCCATGTCAGACGCAGCCGTA-3’，下游引物P2：5’-GCGAATCCCTAGTCATCCTCGTCGGTC-3’，将上游引物P1引入BamHI酶切位点，将下游引物P2引入EcoRI酶切位点；2)采用RT-PCR方法获得前胸腺素α原全长基因cDNA，将PCR产物纯化后与pMD18-TVector连接，重组载体命名为TP，转化DH5α感受态细胞，将鉴定的阳性菌液测序；3)采用生物学软件DNAman对7个单克隆基因序列和参考的proTα的基因序列进行比对；4)用EcoRI和BamHI双酶切ProTαPCR产物，将ProTα基因片断插入经同样双酶切的原核表达载体pGEX 6P-1中，命名为PP，转化大肠杆菌BL21，LB培养基，37℃培养，加入IPTG，37℃诱导表达，菌液离心后的沉淀用上样缓冲液溶解，沸水浴后离心取上清，进行SDS-PAGE电泳，获得GST-Proα融合蛋白；5)将4经过转化的转基因BL21菌株超声破碎后，离心所获得的上清中含有可溶性的融合蛋白GST-Proα；6)将上清经过GST亲和层析柱分离纯化获得高纯度的GST-Proα融合蛋白。