[发明专利]作物种子的脂肪酶活性精确定量检测方法

摘要

本发明属于一种作物种子脂肪酶活性的定量检测方法，是取作物种子的脂肪酶富集部位，用Tris－HCl缓冲液浸提得到酶提取液；配制乙酸铜、吡啶的水溶液，作为脂肪酸显色剂；以tween－20和橄榄油组成的底物乳化液；取酶提取液加入底物乳化液，在35－37℃水浴震荡至反应完毕，再加入异辛烷混匀，移取有机相，加入显色剂，最后离心取上清液于710nm比色；酶活性管中上清液吸光值的高低对应于脂肪酶活性的高低。通过制定脂肪酸标准曲线，将测得的吸光度和反应体系中脂肪酸浓度的变化对应起来，并通过自定义酶活力单位，将不同样品的脂肪酶活力完全量化。该方法用于精确定量时灵敏度高，稳定性好，重现性好，分辨率高。

主权项

1、作物种子脂肪酶活性的定量检测方法，其步骤如下：(1)、取作物种子的脂肪酶富集部位，用Tris-HCl缓冲液浸提得到酶提取液；(2)、配制乙酸铜、吡啶的水溶液，作为脂肪酸显色剂；(3)、配制tween-20和橄榄油组成的底物乳化液；(4)、取酶提取液加入底物乳化液，在35-37℃水浴震荡至反应完毕，再加入异辛烷，充分震荡，将该混合物倒入分液漏斗，静置分层，除去下层水相，移取上层有机相，在该移取液中加入显色剂，充分震荡混匀；最后离心取上清液于710nm比色；酶活性管中上清液吸光值的高低对应于脂肪酶活性的高低；(5)、脂肪酸吸光度工作曲线的制定和脂肪酶活力的定义与计算，配制一系列不同浓度的正辛酸/异辛烷溶液于离心管中，在步骤(4)同样的反应条件下，加脂肪酸显色剂，震荡离心后取上层有机相在710nm下测定吸光度，用异辛烷作参比，以吸光度对正辛酸浓度作图，得一直线，即为脂肪酸吸光度工作曲线，由曲线得到计算种子脂肪酶活力的计算公式；同时，将每ml反应体系中生成0.001mg脂肪酸定义为一个酶活力单位U。