[发明专利]快速分离、浓集与检测重要疾病病原体的方法

摘要

本发明公开了一种快速分离、浓集与检测重要疾病病原体的方法，包括如下步骤：(1)制备纳米免疫磁颗粒悬液：①葡聚糖纳米磁颗粒的制备；②纳米免疫磁颗粒悬液的制备；(2)免疫层析试纸条的制备(3)检测：①在检测样本中加入纳米免疫磁颗粒悬液，吸附，磁板吸引，弃上清后洗涤，加入生理盐水制成悬液；②将免疫层析试纸条的样品板端插入悬液中；③观察免疫层析试纸条上的溶液泳动到吸收纸时，取出免疫层析试纸条，放置2～20分钟观察结果，本发明操作简便，不需要任何仪器设备，检测快速，纳米免疫磁颗粒浓集、分离病原体只需2～30分钟，免疫层析试纸条检测病原体只需2～15分钟，非常适于现场快速检测病原体。

主权项

1.快速分离、浓集与检测重要疾病病原体的方法，其特征是包括如下步骤：(1)制备纳米免疫磁颗粒悬液：①葡聚糖纳米磁颗粒的制备：a.将0.5～1.2mol/L的FeCl3·6H2O水溶液10～20ml与0.5～2.5mol/L FeCl2·4H2O水溶液2～6ml混合，在氮气氛下，滴加至10～30ml的30～70％的葡聚糖T-40水溶液中，所述葡聚糖T-40水溶液的浓度为g/ml百分比浓度，混合，50～70℃，水浴10～30分钟，在150～500转/分钟的搅拌下，10～30分钟内，向混合液中滴加3～7mol/L的氨水35-45ml，温度保持50～70℃，并始终通氮气，制成悬液；b.将悬液用乙酸或稀盐酸调至pH为6.0-8.0；c.将悬液中的聚集体在离心力为600×g，离心10～20分钟去除；游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗粒分离，洗脱平衡液为pH为6～pH为8的0.005～0.02mol/L磷酸盐缓冲液，收集的颗粒冷冻干燥，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为5～10mg/ml；d.取葡聚糖纳米磁颗粒悬液0.5～2.0ml，加入10～30mmol/L NaIO4水溶液0.25ml，150转/分钟避光阻氧震荡0.5～12小时后，加入1-3mol/L乙二醇的水溶液0.1～0.3ml终止氧化，用pH为6～pH为8的0.005-0.02mol/L磷酸盐缓冲液4℃透析18～48小时，去除过量的NaIO4，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为3～8mg/ml；②纳米免疫磁颗粒悬液的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10～30μg/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的SARS冠状病毒抗体或霍乱弧菌抗体或嗜肺军团杆菌抗体或沙门氏菌抗体或副溶血弧菌抗体或流行性感冒病毒抗体或丙型肝炎病毒抗体，混匀后，4℃避光放置6～24小时，加入0.2～1mol/LNaBH4水溶液还原10～60分钟，加入NaBH4的量为0.1～0.5ml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液，多余的抗体用Sephacryl S-300凝胶层析柱过滤与结合物分离，制成纳米免疫磁颗粒悬液；(2)免疫层析试纸条的制备在纸质或塑料载体表面设置硝酸纤维素膜，在所述硝酸纤维素膜表面的一端设置样品板，在所述硝酸纤维素膜与样品板之间设置胶体金探针结合物垫，所述胶体金探针结合物垫的长度为所述样品板长度的1/4～1/2，所述胶体金探针结合物垫的一端与所述样品板的近中端齐平，所述硝酸纤维素膜表面的另一端设置吸水纸，在所述样品板与所述吸水纸之间依次设置对照线、病原体检测线，所述胶体金探针结合物垫结合有SARS冠状病毒抗体或霍乱弧菌抗体或嗜肺军团杆菌抗体或沙门氏菌抗体或副溶血弧菌抗体或流行性感冒病毒抗体或丙型肝炎病毒抗体；(3)检测①在1ml检测样本中加入纳米免疫磁颗粒悬液2～20μl，吸附3～20分钟，在15～35℃，磁板吸引2-10分钟，弃上清后用含体积百分比为0.05％～0.1％的吐温-20的0.005～0.01mol/L的磷酸盐缓冲液0.5～1.0ml洗涤一次，加入0.5～5.0ml生理盐水制成悬液；②将免疫层析试纸条的样品板端插入步骤①制成的悬液中，控制所述悬液不要没过样品板的近中端；③观察免疫层析试纸条上的溶液泳动到吸收纸时，取出免疫层析试纸条，放置2～20分钟观察结果。