[发明专利]α－葡萄糖苷酶固定化方法

摘要

本发明涉及一种α－葡萄糖苷酶固定化的工艺方法，属有机化学酶化学工程技术领域。本发明的一种α－葡萄糖苷酶的固定化方法，其特征在于以壳聚糖为载体，用三羟甲基磷交联固定α－葡萄糖苷酶，该方法具有以下工艺步骤：(1)壳聚糖的预处理，使脱去乙酰基，获得高脱乙酰度的壳聚糖；(2)用四羟甲基氯化磷和KOH反应制取三羟甲基磷；(3)交联固定α－葡萄糖苷酶：将前述经预处理过的壳聚糖迅速加入至上述的含有三羟甲基磷的反应液中，在室温下反应8分钟，然后过滤，水洗、磷酸钾缓冲液洗涤，最后加入浓度为0.1U/mL的α－葡萄糖苷酶1ul；在5℃下进行固定化，时间为2小时；待固定化完毕，在依次用水、磷酸钾缓冲液洗涤，最后在4℃下保存好固定化的α－葡萄糖苷酶。

主权项

1.一种α-葡萄糖苷酶的固定化方法，其特征在于以壳聚糖为载体，用三羟甲基磷交联固定α-葡萄糖苷酶，该方法具有以下工艺步骤：a.壳聚糖的预处理：先制备高脱乙酰度壳聚糖，取一定量的壳聚糖，加入一定浓度的NaOH溶液，在130℃下搅拌反应时间5小时，然后水洗至中性，在105℃下干燥，经粉粹，过120目的筛，得到经预处理的壳聚糖，其脱乙酰度为93％；b.三羟甲基磷的制备：取等摩尔量的四羟甲基氯化磷和KOH，分别溶于水中，在室温和剧烈搅拌下把KOH水溶液滴加到四羟甲基氯化磷水溶液中，滴加完毕则反应结束，得三羟甲基磷；c.交联固定α-葡萄糖苷酶：将前述经预处理过的壳聚糖迅速加入至上述的含有三羟甲基磷的反应液中，在室温下反应8分钟，然后过滤，并水洗残留的四羟甲基氯化磷，然后再用pH6.0，含有1mM的巯基乙醇和0.5mM的EDTA的磷酸钾缓冲液进行洗涤，最后加入浓度为0.1U/mL的α-葡萄糖苷酶1ul；在5℃下进行固定化，时间为2小时；待固定化完毕，用PH6.8的磷酸钾缓冲液洗出未交联的α-葡萄糖苷酶，然后在采用考马斯亮蓝G-250法的监测下，进一步用1M的NaCl水溶液洗尽未交联的酶，接着再依次用水、PH6.8的磷酸钾缓冲液洗涤，最后在4℃下保存存在于缓冲液中的固定化的α-葡萄糖苷酶。