[发明专利]重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因的克隆、工程菌的构建与鉴定以及工业化生产的方法无效
| 申请号： | 200410055553.3 | 申请日： | 2004-08-04 |
| 公开（公告）号： | CN1706953A | 公开（公告）日： | 2005-12-14 |
| 发明（设计）人： | 刘建宁;陈于红;张菁;孙自勇;朱镇华;张巍 | 申请（专利权）人： | 南京大学生物制药工程研究中心 |
| 主分类号： | C12N15/57 | 分类号： | C12N15/57;C12N15/11;C12N9/48;A61K38/49;A61P7/02 |
| 代理公司： | 南京天华专利代理有限责任公司 | 代理人： | 夏平 |
| 地址： | 210093江苏省南京*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明属于生物制药领域中应用基因工程技术生产蛋白质药物的范畴。本发明公开了一种新的具有快速溶栓效果的人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体蛋白K2tPA的制备方法和应用。其制备方法是用基因工程技术构建了表达K2tPA的重组质粒，并实现了在大肠杆菌中的高效表达。将含有人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)重组表达质粒的工程菌经10L种子罐培养及100L发酵，每100L发酵液得重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)纯品4g，纯度达95％以上，比活大于50万IU/mg，内毒素及热源含量、宿主蛋白残留量、宿主DNA残留量等均达到临床使用标准，可用于心、脑血管疾病的血栓形成的治疗。 | ||
| 搜索关键词： | 重组 组织 型纤溶酶原 激活剂 缺失 变体 基因 克隆 工程 构建 鉴定 以及 工业化 生产 方法 | ||
【主权项】：
1.一种重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因的克隆、工程菌的构建与鉴定以及工业化生产的方法，其特征在于：a.从人脐带静脉上皮细胞中克隆人组织型纤溶酶原激活剂基因，将其接入TA克隆载体PCR2.1中，以该重组质粒DNA为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)获得了重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因(K2tPA)；b.将上述重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因(K2tPA)与表达质粒pET29a通过基因重组的方法构建重组表达质粒pET29a/K2tPA，将重组后的表达质粒pET29a/K2tPA转化宿主菌BL21(DE3)，构建成表达重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体蛋白(K2tPA)的工程菌；c.将上述表达重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体基因(K2tPA)的工程菌每隔3个月取出生产种子一支，进行质粒稳定性及表达稳定性鉴定；d.将重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)工程菌经种子罐培养及发酵罐工业化生产，经IPTG诱导表达后，其表达量用占菌体总蛋白的百分含量来表达。
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