[发明专利]黑鲷肿瘤坏死因子α基因的重组表达方法

摘要

本发明涉及分子生物学技术领域，是黑鲷肿瘤坏死因子α(BS TNFα)基因的体外表达与纯化技术。本发明包括重组表达载体的构建、转化、转化子筛选和表达产物的分离纯化和鉴定等技术环节。其中重组体的构建是根据黑鲷肿瘤坏死因子α预测成熟肽的cDNA序列设计引物，引入两个不同的限制性内切酶突变位点，然后克隆到表达载体，再将构建成的重组表达载体转化大肠杆菌和酵母，筛选阳性克隆并以IPTG或甲醇诱导重组蛋白的表达。利用亲和层析对表达产物进行多级纯化，获得高纯度体外表达的重组肿瘤坏死因子α。该产品可用于鱼类免疫机制的理论研究，也可作为饵料添加剂、免疫增强剂、病害防治药物等在生产方面进行应用。

主权项

1.黑鲷肿瘤坏死因子α基因的重组表达方法，包括重组载体构建、转化与筛选、表达产物的分离纯化和鉴定，其特征在于：1)重组载体构建：根据黑鲷肿瘤坏死因子α成熟肽的cDNA序列，利用一对特异性引物rTF和rTR在其两端引入BamHI和HindIII两个不同的限制性内切酶位点，克隆到表达载体，载体包括pQE系列、pET系列、pGEX-4T系列，pPIC系列以及pGAPZ系列；2)转化与筛选将构建的得到的重组表达载体转化到大肠杆菌DH5α、Jm109、XL1-blue或毕赤酵母、巴斯德酵母中，进行PCR双向筛选；获得的阳性克隆进行质粒纯化，限制性内切酶消化验证；并经序列测定鉴定后，所筛选的阳性克隆作为预备工程菌株，分别对细菌或酵母进行诱导表达；3)表达产物的分离纯化：采用诱导剂诱导工程菌的表达，直接取上清液或经裂解液或玻璃珠裂解细胞，用亲和层法进行纯化，SDS-PAGE电泳鉴定。