[发明专利]含乳铁蛋白全蚕粉的生产方法

摘要

本发明公开了含乳铁蛋白全蚕粉的生产方法，它是以杆状病毒为载体，用家蚕为生物反应器生产含乳铁蛋白全蚕粉的。应用本发明方法生产含乳铁蛋白全蚕粉，产率高，在生产和使用过程中对人畜安全无毒，适宜大批量生产和使用。以此方法生产的含乳铁蛋白全蚕粉因含有杀菌抗病毒的乳铁蛋白，故作为饲料添加剂在补充饲料蛋白的同时可起到抗病防病的作用，而且动物不会产生抗药性，可部分或全部替代饲料中的抗生素。

主权项

1.含乳铁蛋白全蚕粉的生产方法，其特征是包括以下步骤：1)取泌乳1-21天母畜乳腺腺泡，液氮冷冻研磨成粉末，提取总RNA并通过反转录得到LF-cDNA，根据乳铁蛋白基因特征设计一对各带一个酶切位点的引物，利用RT-PCR技术得到DNA，PCR产物割胶纯化后，用引物中对应的两个内切酶双酶切，定向连接入以上两个酶切过的pGEM-3Z载体，转化大肠杆菌TG-1，蓝白斑筛选阳性克隆，再接种3ml液体LB培养基，37℃摇床200rpm振荡培养至少8小时；2)将以上培养的TG-1抽提质粒，对应双酶切，割胶回收目的片段，定向克隆进转移载体pVL1393，得到重组转移载体pVL1393-LF，同时用Bsu36I酶切野生型杆状病毒DNA，在透明的聚苯乙烯灭菌管中加入下列试剂：pVL139315.0μl，野生型杆状病毒DNA1.0μL，灭菌水10.0μL，lipofectin14.0μL轻轻混匀，常温下放置15分钟，在此期间待转染的家蚕细胞吸去培养基，用无血清TC-100培养基洗三次，最后加入2mL无血清TC-100培养基，15分钟以后，用移液器吸取上述40.0μL共转染试剂，分三处滴入细胞中，轻轻摇匀，然后用parafilm密封，27℃培养5天；3)待细胞贴壁后，吸去培养液，将母液按10-3、10-4、10-5的浓度梯度进行稀释，吸取1μL的病毒稀释液接种到贴壁细胞中，摇动使之均匀，27℃感染1小时后，移去接种液，在病毒接种时将3％低熔点琼脂糖熔化，保温在40℃水浴中，然后与等体积预热到40℃的含20％胎牛血清的2XTC-100快速混合均匀，将此混合液轻轻加到已移走接种液的贴壁细胞上，等胶凝固后封口，逐日观察病毒斑生长情况，当病毒斑明显后，在显微镜下挑取分隔良好的12个病毒斑，接种于5×104细胞密度且已贴壁生长的24孔板中，至细胞呈感染态时，收集病毒液，向残余的细胞中添加100μgX-gal的溶液，37℃温育1小时后，选取白斑按上述步骤进一步筛选，重复筛选至获得重组病毒HyBacPAK-LF；4)将纯化的重组病毒每头约106pfu注射5龄起蚕，喂给新鲜桑叶，饲养五天后于冰上收集蚕血，加入0.1％苯基硫脲，10000rpm离心10分钟，取上清，再注射5龄起蚕，106pfu/头，喂给新鲜桑叶，饲养5天，待家蚕发病后，收集病蚕冷冻干燥，粉碎，即得含乳铁蛋白的全蚕粉。