[发明专利]一种人重组分泌型内皮抑素蛋白及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种人重组分泌型内皮抑素蛋白及其制备方法和其应用，本发明的人重组分泌型内皮抑素蛋白是利用RT－PCR技术，从中国人胎肝组织中克隆内皮抑素(endostatin)基因，构建一种新型的endostatin分泌型酵母表达质粒pGAPZαA－endostatin，由琼脂糖电泳回收质粒DNA，与酵母菌GS115的感受态菌液混合进行电转化；利用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选重组阳性表达酵母菌；经SepharoseG25和肝素亲和层析柱过柱分离、纯化制得，分子量约为32KD，包括至少183个氨基酸。应用于眼角膜新生血管形成等疾病的治疗。

主权项

1.一种人重组分泌型内皮抑素蛋白，其特征是，可通过下述方法制得：(1)从新鲜胎肝组织抽提总RNA；(2)利用内皮抑素互补DNA(cDNA)序列，设计上下游引物P1、P2，其中在上游加入EcoRI酶切位点，下游加入NotI酶切位点；(3)以上述抽提的总RNA为模板，进行逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)，获得内皮抑素cDNA；(4)通过凝胶电泳、质粒抽提、离心法回收内皮抑素cDNA；(5)以上述回收的cDNA，与克隆质粒(pGEM-T)连接，转化大肠杆菌JM109。(6)以P1、P2为引物进行PCR扩增，筛选扩增阳性的含内皮抑素基因的克隆，抽提质粒DNA，测序鉴定；(7)以常规方法利用限制性内切酶EcoRI、NotI双酶切含内皮抑素(endostatin)基因的克隆质粒(pGEM-endostatin)，实现与pGAPZαA酵母表达质粒的连接；(8)取步骤7的连接产物转化大肠杆菌JM109，筛选含内皮抑素(endostatin)基因的阳性重组表达载体工程菌，抽提质粒DNA，测序鉴定；(9)以限制性内切酶AvrII单酶切含endostatin基因的重组酵母表达质粒pGAPZαA-endostatin，0.8％琼脂糖电泳回收完全线性化的质粒DNA，与酵母菌GS115的感受态菌液混合进行电转化；(10)利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选重组阳性表达酵母菌；(11)取上述重组阳性表达酵母菌经SepharoseG25和肝素亲和层析柱过柱分离、纯化，制得内皮抑素(endostatin)表达蛋白，即人重组分泌型内皮抑素蛋白，分子量约为：32KD，包括至少183个氨基酸。