[发明专利]异硫氰酸苯酯衍生化法测定微透析样品中氨基酸的方法

摘要

本发明涉及一种异硫氰酸苯酯衍生化法测定脑内透析样品中氨基酸的方法，属生物医学领域。该方法由样品的采集(即脑内微透析)、样品的衍生和干燥以及HPLC分离等组成。实验前一周，在动物特定部位埋植透析导管。待恢复后，安装透析探针，并以一定流速灌流人工脑脊液，间隔一定时间收集一次透析样品。然后，在样品中加入一定量的内标试剂，经冷冻干燥、异硫氰酸苯酯衍生、再干燥、稀释等步骤处理后，样品经反相HPLC洗脱，紫外检测。本发明具有简便快速、衍生产物稳定、分析时间短、化学选择性和分析灵敏度高(可达1pmol)、一、二级氨基酸均可检测的分析方法，由此可实现微透析与反相高压液色谱紫外检测技术结合对脑内痕量活性物质的动态监测。

主权项

1.一种采用异硫氰酸苯酯衍生化法测定脑内微透析样品中痕量氨基酸的方法，由脑内微透析、样品的衍生和干燥、样品的洗脱等组成，其特征在于：1.1脑内微透析过程中灌流液组分为NaCl147、KCl2.4、CaCl21.2、MgCl21.0、NaHCO35.0、pH7.4，组分单位mmol/L，灌流速度为1.5μl/min，灌流3小时平衡后每20分钟收集样品一次；1.2样品的衍生和干燥过程中向样品中加入10μl5pmol/μL蛋氨酸砜溶液作为内标，再干燥液为甲醇∶水∶三乙胺＝2∶2∶1，衍生化试剂为甲醇∶异硫氰酸苯酯∶三乙胺∶水＝7∶1∶1∶1，样品真空干燥后加入再干燥液20μl，混匀，再真空干燥，向再干燥后的样品中加入衍生化试剂40μl，混匀，室温下放置20分钟使充分反应后真空干燥，干燥后的样品放入冰箱-21℃冷冻保存；1.3.样品的洗脱过程中的洗脱液A为含2％乙腈的70mmol/L醋酸钠缓冲溶液，其pH＝6.38；洗脱液B为乙腈∶甲醇∶重蒸馏水＝45∶15∶40；流速为1ml/min；色谱柱温为35℃；检测：紫外，254nm；检测限为1pmol。