[发明专利]一种高产量大规模质粒制备方法

摘要

本发明一种高产量大规模质粒制备方法,包括菌落培养与收集原生质体制备质粒的抽提纯化用DNA检测仪测定质粒含量并用适当的酶作酶切鉴定;本工艺与碱变性－CsCl密度梯度超速离心法所制备质粒的纯度相当,而产量却大幅度提高,每1000ml大肠杆菌培养物的质粒产量达到15－23mg。第一次在上清中沉淀质粒使用20%的PEG8000而不使用异丙醇,并将沉淀加入18TE溶液溶解,加入终浓度为50－100ug/ml的蛋白酶K消化。其内毒素含量极低,与碱变性－CsCl密度梯度超速离心法的相当。

主权项

1、一种高产量大规模质粒制备方法，包括以下步骤：1)菌落培养与收集：挑目的单菌落接种至LB培养基，加入相应量抗生素，至细菌生长至密度为OD600≈0.6，将其再接种至20倍体积的LB培养基中培养12-16小时左右，5000rpm，10分钟离心，弃尽上清，收集菌体；2)原生质体制备：用溶菌酶将上述收集细菌的细胞壁水解，制成原生质体。3)质粒的抽提纯化：用SDS-碱变性法将质粒从细菌中释放出来至溶液中，在该步骤中，溶液I先使用标准溶液I的4～6倍浓度，在原生体分散均匀后，用蒸馏水调整至标准溶液I的浓度并向溶液I中加入高浓度的RNA酶A；质粒从细菌中释放出来至溶液后，离心取上清加入1/2体积20％的PEG8000溶于2.4M的NaCl溶液，冰浴30-60分钟或放4℃冰箱过夜；12000g，离心5分钟或8000g，15分钟；弃上清，沉淀加入18mlTE溶解；加入终浓度为50-100ug/ml的蛋白酶K，56℃，消化直至清亮；加入等体积的酚、酚/氯仿/异戊醇、氯仿抽提，直至无蛋白带出现；取上清，加入0.1体积3MNaAC(pH5.2)，2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻吹吸或摇晃后，4℃，30分钟以上；12000rpm，离心10分钟，弃上清；加入少量70％的乙醇，轻轻洗刷管底沉淀物及管壁上粘附的盐类，然后置室温凉干；4)适量双蒸水或PBS溶解质粒沉淀，用DNA检测仪测定质粒含量并用适当的酶作酶切鉴定；5)鉴定后分装，-20℃保存。