[发明专利]带有人lgG1Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子的制备方法及其制品的用途

摘要

本发明属于基因工程领域,涉及一种带有人IgG1Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子的制备方法及其制品的用途,它是通过PCR方法从人胎儿肾脏细胞cDNA文库中筛选得到的Endostatin和人IgG1Fc的基因片段经过T4连接酶组成一个新的基因片段,通过基因克隆方法在酵母菌中发酵、表达,经纯化得到具有高效表达、可溶性、无需复性、修饰及糖基化的纯品,能专一抑制肿瘤血管内皮细胞增殖,与不带IgG1Fc的Endostatin相比可增加Endostatin半衰期,减少Endostatin用量的10倍,使更具有药理学、药效学、药代动力学等意义,可用于多种肿瘤的治疗。

主权项

1.一种带有人IgG1Fc片段分子结构的重组人血管内皮细胞生成抑制因子-Endostatin的制备方法是经过基因克隆、酵母菌发酵和纯化过程制备而得，其步骤如下：a.通过PCR方法从人胎儿肾脏细胞cDNA文库中筛选得到人胶原蛋白十八--humantypeXVIIIcollagen基因1503至2055cDNA活性片段，首先合成两种引物分别为CCGCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTCACAGC和CGCGGATCCACCACCTCCCTTGGAGGCAGTCATGAAGCT，以人胎儿肾脏细胞cDNA库为模板，以PCR条件94℃2分钟、55℃2分钟和72℃2分钟共做30个循环得到重组人血管内皮细胞生成抑制因子-Endostatin基因片段；b.将新基因片段克隆入TAVectohk质粒中，通过两种内切酶酶切，经电泳纯化得到的576bp基因片段；c.然后再合成两种引物：GGTGGATCCGGTGGAGGAGGAAGCGGAGGTGGAGGGTCCGTCGACAAAACTCAC和CCGCGGCCGCCGCACTCATTTACCCGGAGACAG，以人胎儿肾脏细胞cDNA库为模板，以PCR条件94℃2分钟、55℃2分钟和72℃2分钟共做30个循环得到的人IgG1Fc基因片段；d.将上述基因片段克隆入TAVectohk质粒中，通过两种内切酶酶切，经电泳纯化得到的729bp基因片段；e.将克隆得到的两个基因片段用连接酶连接后再克隆入pPICZαA质粒两种内切酶位点中，构成PLW205基因载体；f.将上述基因载体PLW205转入X--33酵母菌中，使用平板培养得到抗性菌株后，经筛选得到高效表达的基因工程酵母菌株-LW205；g.经发酵诱导表达的菌液采用生物分离技术等手段纯化得到的带有IgG1Fc重组人血管内皮细胞生成抑制因子Endostatin蛋白质；h.将纯化得到的带有IgG1Fc重组人血管内皮细胞生成抑制因子Endostatin蛋白加入到含有bFGF的牛肾上腺毛细血管内皮细胞培养液中，培养3天后通过细胞计数和细胞染色方法，测定抑制毛细血管内皮细胞增殖的活性。