[发明专利]脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法

摘要

本发明涉及人工合成DNA的必备前体原料的制备方法。本发明采用酶解—酶促—化学合成全新工艺。采用天然DNA经溶液态脱氧核糖核酸酶的酶解可得到DNMP，DNMP收率为70-90％。DNMP在经DNMP酶反应一步后结合化学反应，可分别转化为相应的DNTP，经层析法纯化，以钠盐或钡盐的形式沉淀分离，可以得到纯度为95％-97％的DNTP。本发明不仅使DNTP的生产工艺变的简单，而且使生产量达到了摩尔级，适于工业生产，并且污染性极小。

主权项

1、一种脱氧核糖核苷三磷酸的制备方法，包括以下步骤：(1)酶解：DNMP酶制备的培养基的基本组成为5-10％的细菌培养用酵母提取物、0.5-2％的蛋白胨、4-6％的磷酸二氢钾、2-5％的磷酸氢二钾、10-15％的葡萄糖、0.5-3％的尿素、0.2％的氯化钙、0.2％的氯化锌，余量为水溶液；该DNMP酶制备的培养基经1.2公斤/平方厘米的蒸汽灭菌消毒后，接种，接种量为20-30％，50℃下强烈搅拌培养10-30小时，在1℃下离心收集菌体；菌体经高速搅拌后，用PH2-7的缓冲液萃取；缓冲液是柠檬酸钠-氢氧化钠-盐酸、氯化钾-盐酸、乙酸-乙酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾、磷酸二氢钾-氢氧化钠、磷酸氢二钠-柠檬酸或邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠溶液；该萃取液不经纯化直接使用；将商品DNA分散在水中制得DNA水溶液，在所述DNA溶液中加入锌离子使其浓度达到2×10-2-1×10-4M，根据脱氧核糖核酸酶的活性加入脱氧核糖核酸酶的量为DNA溶液量的二十至五十分之一。，酶解在30-55℃下进行；酶解5-15小时；(2)酶促：DNMP水溶液用10M的氢氧化钾溶液调节PH为4-8，加入磷酸盐，再加入金属离子，用ATP作催化剂，根据DNMP酶的活性加入DNMP酶，50-55℃保温48-96小时；(3)化学合成：酶促反应完成后，加入等量的醇类溶剂，2-5倍量的磷酸或磷酸盐，20-40倍量的DCC，80-90℃下反应4-8小时；所得混合液为磷酸盐，DNMP、DNDP、DNTP和多磷化合物；该溶液经过层析分离得到纯净的DNTP。