本发明提供一种检测LHON致病突变的CRISPR‑Cas组合物、试剂盒和方法,涉及基因检测技术领域。本发明提供的CRISPR‑Cas组合物和试剂盒包括Cas12a蛋白和SEQ ID NO.1/11/17所示的crRNA,其可用于精准地检测样品的LHON的三个原发突变位点(m.3460GA、m.11778GA和m.14484TC),具有检测快速、简便易操作、特异性和灵敏度高、可视化,无需大型仪器和昂贵试剂等特点,为LHON快速诊断提供了分子基础,而且适用于在人群中大规模筛查突变携带者,为其遗传咨询和产前诊断提供帮助。