本发明提供一种检测高毒力肺炎克雷伯菌的荧光定量PCR引物组、试剂盒及应用。本发明针对高毒力肺炎克雷伯菌中编码铁摄取系统相关基因iucA、iroB,代谢转运相关基因peg‑344,荚膜多糖相关基因rmpA,分别设计了针对基因iucA的特异性引物SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:6、针对iroB基因的特异性引物SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:8、针对peg‑344基因的特异性引物SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:10和针对rmpA基因的特异性引物SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:12,建立了可检测肺炎克雷伯菌中高毒力相关基因iucA、iroB、peg‑344、rmpA的荧光定量PCR方法,通过对高毒力相关基因的检测来判定菌株为高毒力肺炎克雷伯菌或经典肺炎克雷伯菌。本发明方法采用闭管反应,基于熔解曲线峰进行结果判定,检测完毕直接处理,避免开盖造成气溶胶污染,可以快速、准确地进行高毒力肺炎克雷伯菌的检测。