本发明涉及制备环化核酸适配体领域,提供了一种重组ssDNA核酸环化酶、制备方法及应用。该重组ssDNA核酸环化酶是一种分离自噬菌体TS2126热稳定的核酸环化酶Circligase,通过对其进行密码子优化改造后,经化学合成,构建了重组表达载体pET22b‑Circligase,并转入E.coil大肠杆菌表达系统,以IPTG作为诱导剂,表达出的一种重组蛋白ssDNAligase,其氨基酸序列和基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明的重组蛋白经功能性实验证明,对不同长度的ssDNA均有稳定高效的环化效果,且和已商品化同类产品拥有相近甚至更优秀的催化效率,适用于核酸适配体的环化修饰和相关功能研究。